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一种用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物及其制备方法和应用与流程

文档序号:24930589发布日期:2021-05-04 11:19

本发明涉及水体环境抑菌剂技术领域,更具体地,涉及一种用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物及其制备方法和应用。



背景技术:

迟缓爱德华氏菌是一种危害较大的革兰氏阴性致病菌,其菌体大小约1-4μm,兼性厌氧,不形成芽孢,以周生鞭毛作为运动器官,普遍存在于全球的淡水、海水环境中,4-10℃能够生长,最适生长温度25-32℃,42℃以上不生长,ph值范围5.5-9。在含盐0-4%的范围内均能生长。

迟缓爱德华氏菌对鳗、鲇、鲆、蛙等无鳞养殖品种具有较强的致病性,通过粘附于饵料进入鱼体内或是通过鱼类的消化道、鳃或受伤的表皮侵入鱼体,其引起的疾病被列为三类动物疫病,主要发生在水温15℃以上,在水温25-30℃为疾病发生高峰期。实际养殖中,在广东、湖北、四川等无鳞养殖地区,比较常见的现象是:当水体温度和有机质等条件适合迟缓爱德氏菌快速繁殖时,迟缓爱德华氏菌对斑点叉尾鮰、沟鲇、黄颡鱼的致病风险大大提升,一旦进入鱼体引起发病,一是会拖延有效投喂时间,二是用药成本增加,三是化药的使用导致药残风险。

通过抑制迟缓爱德华氏菌在水体的异常繁殖,从而切断迟缓爱德华氏菌的传播风险,都是常用的防控手段之一,二氧化氯、聚维酮碘和钾盐等常用消毒剂商品,虽具有良好的安全性和杀菌能力,但易受水体有机物含量影响,往往在迟缓爱德华氏菌病发生时,按常规剂量使用一般难以达到杀菌效果,而加大剂量至有杀菌效果时,单个疾病周期内2-3个消毒疗程的总使用成本都很高,大大降低养殖户的使用意愿;而基于对不同中草药水煮物筛选抑制迟缓爱德华氏菌的研究报道中,虽然能明确部分中草药水煮物具有抑菌作用,但其比较突出的问题仍然是换算为生产应用时剂量过高与对应使用成本过高,转化为生产应用的价值较低。因此,基于有效的降低迟缓爱德华氏菌的传染风险,对标起效剂量和起效速度两个维度,开发一种比传统消毒剂商品和研究报道的相关中药水煮物更有效抑制养殖水体环境中迟缓爱德华氏菌的异常繁殖的绿色安全消毒剂,既符合无鳞鱼健康养殖有效防控迟缓爱德华氏菌感染的需求,也具有十分重大的技术创新价值。



技术实现要素:

本发明为了克服现有技术中上述缺陷,首先提供一种用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物。

本发明的第二个目的是提供上述用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现:

一种用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物,以重量百分比计,包括55-65%紫背草鲜叶提取物、26-35%马齿苋提取物、12-18%金不换茎提取物。

优选的,所述的用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物,以重量百分比计,包括55-60%紫背草鲜叶提取物、25-30%马齿苋提取物、15-18%金不换茎提取物。

作为一种最优选的实施方式,所述的用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物,以重量百分比计,包括56%紫背草鲜叶提取物、26%马齿苋提取物、18%金不换茎提取物。

优选的,所述紫背草鲜叶提取物是经过醋制后的发酵浓缩物。

优选的,上述紫背草鲜叶提取物的制备方法为:

s1、紫背草鲜叶预处理:将紫背草鲜叶与食盐(紫背草鲜叶与食盐的质量比为1:80-1:100)混合研磨捣碎,捣碎物与醋按照质量体积比为1:(10-15)混合,置于室温33-35℃环境中密闭混合8-10天,期间保持每3-4h间隔搅拌2-5min,得到醋制紫背草鲜叶;

s2、将醋制紫背草鲜叶与水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌混合,33-37℃密闭培养至od值为6.0-7.5得到培养物,将培养物离心去渣,收集上清液,超滤浓缩至原体积的10%-30%,所获得的浓缩液即为所述紫背草鲜叶提取物;其中,醋制紫背草鲜叶物:水:乳酸菌液态培养基的重量体积比为8-10:16-30:3-6,乳酸菌的加入量为每质量份醋制紫背草鲜叶物加入(2-6)╳105cfu。

其中,上述经过醋制紫背草鲜叶物、水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌的混合没有加入顺序的限制,例如采用先将经过醋制紫背草鲜叶物和水混合,再加入乳酸液态培养基混合,最后加入乳酸菌混合。

其中,所述浓缩条件为:温度25-30℃,操作压力为0.3-0.6mpa,超滤膜的膜通量以50-100l/m2·h。

优选的,上述紫背草鲜叶提取物中的紫背草鲜叶为经45℃烘烤至含水量40%-50%的鲜摘紫背草叶,鲜摘时删除腐败叶、枯叶、卷黄叶和虫驻叶等。

进一步的,上述紫背草鲜叶提取物中的水优选无菌蒸馏水。

进一步的,上述的乳酸菌优选为葡聚糖明串珠菌,粪肠乳球菌、干酪乳球菌等乳酸菌功能不能取代本发明葡聚糖明串珠菌。

进一步的,上述培养物离心优选在5000rpm离心,例如5000rpm离心10分钟。

作为一种更优选的实施方式,上述紫背草鲜叶提取物的制备方法为:

紫背草鲜叶与(1/100-1/80)食盐按质量百分比混合并充分研磨成捣碎物,将捣碎物为与陈醋溶液按质量体积比1:(10-12)混合,置于室温33-35℃环境中密闭混合8-10天,期间保持每3-4小时间隔搅拌3-5min,取出醋制紫背草鲜叶物,将醋制紫背草鲜叶物与水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌混合,33-37℃密闭培养至od值为6.4-7.5得到培养物,将培养物离心去渣,收集上清液,接着在环境温度25-30℃条件下,将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.4~0.5mpa,超滤膜的膜通量以60l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积的10%-30%的浓缩液即为所述紫背草鲜叶提取物;其中,经过醋制紫背草鲜叶物:水:乳酸菌液态培养基的重量体积比为(8-10):(16-25):(4-6),乳酸菌的加入量为每质量份醋制紫背草鲜叶物加入(4-6)╳105cfu。

作为一种最优选的实施方式,上述紫背草鲜叶提取物的制备方法为:

紫背草鲜叶与(1/100)食盐按质量百分比混合并充分研磨成捣碎物,将捣碎物为与陈醋溶液按质量体积比1:10混合,置于室温33-35℃环境中密闭混合8-10天,期间保持每3-4小时间隔搅拌4-5min,取出醋制紫背草鲜叶物,将醋制紫背草鲜叶物与水、乳酸菌液态培养基和乳酸菌混合,33-37℃密闭培养至od值为7.0-7.5得到培养物,将培养物离心去渣,收集上清液,接着环境温度28℃条件下,将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.5mpa,超滤膜的膜通量以60l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积20%的浓缩液即为所述紫背草鲜叶提取物。其中,经过醋制紫背草鲜叶物:水:乳酸菌液态培养基的重量体积比为8:22:5,乳酸菌的加入量为每质量份醋制紫背草鲜叶物加入5.5╳105cfu。

其中,所述乳酸菌液态培养基可以为市售的乳酸菌液态培养基,例如进口的lactic-bacteriamidium。

其中,上述马齿苋提取物为马齿苋(去除根部的全株)经过发酵、热盐炙后的浓缩物。

优选的,所述马齿苋提取物的制备方法为:

s1、发酵:将马齿苋、水、分枝杆菌液态培养基和分枝杆菌混合,35-40℃密闭培养至od值为3.0-4.5得到培养物,其中,马齿苋:水:分枝杆菌液态培养基的重量体积比为1:6-12:2-4,分枝杆菌的加入量为每质量份马齿苋加入(3-8)╳106cfu;

s2、热盐炙:35-40℃条件下,过滤收集培养物中的经过发酵的马齿苋,置于加温至70-85℃的热锅上,与1/4-1/3质量份的复合盐混合炙炒30-50min,以复合盐完全溶化时收集含盐马齿苋,置于40-45℃条件下烘干至含水量≤8%,并与3-4质量份的水混合,高压灭菌,冷却后取出,离心去渣;

s3、浓缩:离心后收集的上清液超滤浓缩至原体积的10%-25%,获得浓缩液即为所述的马齿苋提取物。

优选的,s2所述复合盐为氯化钾、硫酸镁、硫酸钠的混合物,所述氯化钾、硫酸镁、硫酸钠的混合质量比为20-40:50-65:20-30。

其中,上述马齿苋、水、分枝杆菌液态培养基和分枝杆菌的混合没有加入顺序的限制,例如采用先将马齿苋和分枝杆液态培养基混合,再加入分枝杆菌混合,最后加入水混合均匀。

其中,所述浓缩条件为:温度25-30℃,操作压力为0.3-0.6mpa,超滤膜的膜通量以50-100l/m2·h。

进一步的,上述马齿苋提取物中的水优选无菌蒸馏水。

进一步的,上述培养物离心优选在3000rpm离心,例如3000rpm离心10分钟。

作为一种更优选的实施方式,上述马齿苋提取物的制备方法为:将马齿苋、水、分枝杆菌液态培养基和分枝杆菌混合,35-40℃密闭培养至od值为3.5-4.5得到培养物,33-35℃条件下,过滤收集培养物中的经过发酵的马齿苋,置于在加温至75-85℃的热锅上与1/4-1/3质量份的复合盐混合炙炒30-50min,以复合盐完全溶化时收集含盐将马齿苋,置于43-45℃条件下烘干至含水量≤8%,并与3-4质量份的水混合,分装密闭于121℃下高压灭菌15min,冷却后取出,离心去渣,接着在环境温度25-30℃条件下,将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.4~0.5mpa,超滤膜的膜通量以60l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积18%-20%的浓缩液,获得浓缩液即为所述的马齿苋提取物。其中,马齿苋:水:分枝杆菌液态培养基的重量体积比为1:(8-12):(3-4),分枝杆菌的加入量为每质量份马齿苋加入(5-8)╳106cfu。

作为一种最优选的实施方式,上述马齿苋提取物的制备方法为:将马齿苋、水、分枝杆菌液态培养基和分枝杆菌混合,35-40℃密闭培养至od值为4.0得到培养物,35℃条件下,过滤收集培养物中的经过发酵的马齿苋,置于在加温至85℃的热锅上与1/4-1/3质量份的复合盐混合炙炒30-50min,以复合盐完全溶化时收集含盐将马齿苋,置于45℃条件下烘干至含水量≤8%,并与4质量份的水混合,分装密闭于121℃下高压灭菌15min,冷却后取出,离心去渣,接着在环境温度30℃条件下,将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.5mpa,超滤膜的膜通量以60l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积18%的浓缩液,获得浓缩液即为所述的马齿苋提取物。其中,马齿苋:水:分枝杆菌液态培养基的重量体积比为1:10:3,分枝杆菌的加入量为每质量份马齿苋加入8╳106cfu。

其中,所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基,例如进口的bacillusmediumbase。

上述复合植物提取物中,所述金不换茎提取物是金不换茎经过预处理、发酵后的浓缩物。

优选的,所述金不换茎提取物的制备方法为:

s1、上清液a的获取:金不换茎经过压榨获得金不换茎汁液,保留金不换茎压榨粕,将金不换茎汁液离心收集沉积物,将沉积物与芽孢菌、水、芽孢液态培养基发酵4-6天,取发酵液离心获得上清液a;

s2、金不换茎压榨粕预处理得到金不换茎粉碎物;

s3、上清液b的获取:将金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基和芽孢菌混合,35-40℃密闭培养至od值为4.0-6.5得到培养物,25-28℃条件下,过滤收集培养物,离心收集沉积物,并以离心沉积物的6-10倍质量份加水充分溶解,接着分装密闭,高压灭菌,去渣留离心上清液b;金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基按重量体积比1:6-12:2-4进行混合,芽孢菌的加入量为每质量份金不换茎粉碎物加入(3-8)╳106cfu;

s4、将上清液a和上清液b混合、超滤浓缩,获得浓缩液即为所述的金不换茎提取物。

其中,步骤s2的预处理是:将经过压榨的金不换茎粕用薄膜包裸封口,再经速冻、预膨化、真空脱油处理,获得金不换茎脱水干燥物,干燥物过40-60目筛进行粉碎,获得金不换茎粉碎物。

上述金不换茎粉碎物、水、芽孢菌液态培养基和芽孢菌的混合没有加入顺序的限制,例如采用先将金不换茎粉碎物和芽孢液态培养基混合,再加入芽孢菌混合,最后加入水混合均匀。

其中,上述金不换茎优选植株全长(不含根部长)不低于70cm的完整株,去根部、去鲜叶和去带蕊花托,即为所述金不换茎。

其中,所述浓缩条件为:温度25-30℃,操作压力为0.3-0.6mpa,超滤膜的膜通量以50-100l/m2·h。

进一步的,所述速冻优选为将包裸金不换茎置于-20--40℃速冻10-12h。

进一步的,所述预膨化是将速冻后的包裸金不换茎置于真空度90-95kpa,温度70-80℃的条件下油炸膨化3-6min。

进一步的,所述真空脱油是将油炸后的金不换茎置于转速150-250r/min的条件下脱油6-15min。

进一步的,上述金不换茎提取物中的水优选无菌蒸馏水。

进一步的,上述的芽孢菌优选为多毛发芽孢梭菌,枯草芽胞杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌功能上不能取代本发明的多毛发芽孢梭菌。

作为一种更优选的实施方式,所述金不换茎提取物的制备方法为:按重量份计,金不换茎100份,经过压榨收取金不换茎汁液,保留金不换茎压榨粕,将压榨后的金不换茎汁液,离心去上清,收集离心沉积物,将沉积物与芽孢菌、水、培养基充分发酵5-6天,取发酵离心去沉积,取离心上清液,标记为上清液a。将经过压榨的金不换茎粕用薄膜包裸封口,再经速冻、预膨化、真空脱油处理,获得金不换茎脱水干燥物,干燥物过50-60目筛进行粉碎,获得金不换茎粉碎物,将金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基和芽孢菌混合,36-40℃密闭培养至od值为5.0-6.5得到培养物,26-28℃条件下,过滤收集培养物,4000-5000rpm离心25-30min,弃离心上清液,收集离心沉积物,并以离心沉积物的8-10倍质量份加水充分溶解,接着分装密闭,并于121℃下高压灭菌15min,冷却后取出,800-1100rpm离心6-10min,去渣留离心上清液b,将收集的上清液a和上清液b混合,加入无搅拌式超滤装置浓缩至原体积的10%-20%,获得浓缩液即为所述的金不换茎提取物。其中,金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基按重量体积比1:(8-10):(2-3)进行混合,芽孢菌的加入量为每质量份金不换茎粉碎物加入(5-7)╳106cfu。

作为一种最优选的实施方式,所述金不换茎提取物的制备方法为:按重量份计,金不换茎100份,经过压榨收取金不换茎汁液,保留金不换茎压榨粕,将压榨后的金不换茎汁液,离心去上清,收集离心沉积物,将沉积物与芽孢菌、水、培养基充分发酵5-6天,取发酵离心去沉积,取离心上清液,标记为上清液a。将经过压榨的金不换茎粕用薄膜包裸封口,再经速冻、预膨化、真空脱油处理,获得金不换茎脱水干燥物,干燥物过60目筛进行粉碎,获得金不换茎粉碎物,将金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基和芽孢菌混合,38℃密闭培养至od值为6.5得到培养物,26℃条件下,过滤收集培养物,5000rpm离心25min,弃离心上清液,收集离心沉积物,并以离心沉积物的9倍质量份加水充分溶解,接着分装密闭,并于121℃下高压灭菌15min,冷却后取出,900rpm离心8min,去渣留离心上清液b,接着在环境温度28℃条件下,将收集的上清液a和上清液b混合,装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.4mpa,超滤膜的膜通量以50l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积20%的浓缩液,获得浓缩液即为所述的金不换茎提取物。其中,金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基按重量体积比1:9:3进行混合,芽孢菌的加入量为每质量份金不换茎粉碎物加入6╳106cfu。

其中,所述芽孢菌液态培养基可以为市售的芽孢菌液态培养基,例如进口的bacillusmediumbase。

其中,所述速冻优选为将包裸金不换茎置于-30℃速冻12h。

其中,所述预膨化是将速冻后的包裸金不换茎置于真空度90kpa,温度80℃的条件下油炸膨化5min。

其中,所述真空脱油是将油炸后的金不换茎置于转速200r/min的条件下脱油6min。

其中,上述金不换茎提取物中的水优选无菌蒸馏水。

本发明还提供所述复合植物提取物的制备方法,是在15-40℃下,将各组分按比例混合,所获得的混合液为复合植物提取物。

优选的,上述复合提取物的混合温度为25-30℃,更优选的,上述复合提取物的混合温度为28℃。

本发明还提供所述复合植物提取物的应用,所述复合植物提取物用于抑制养殖水体上层、中层和底层的迟缓爱德华氏菌的异常繁殖;使用剂量≤5mg/l时,可有效抑制养殖水体的上层、中层和底层养殖中的迟缓爱德华氏菌的异常繁殖,且对黄颡鱼、斑点叉尾鮰和沟鲇的安全性良好,当使用终剂量为10mg/l时,其对黄颡鱼、斑点叉尾鮰和沟鲇的安全性都明显下降。

与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:

本发明提供了一种用于水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物,与传统gmp消毒剂安全性相比,本发明复合植物提取物属于环境友好型物质,对无鳞鱼的安全浓度范围大,化水泼洒使用时,其对迟缓爱德华氏菌的抑制效果不会受水体有机物干扰。与传统gmp消毒剂广谱有效性相比,本发明复合提取物作用谱仅对迟缓爱德华氏菌有特效,可用于抑制养殖水环境迟缓爱德华氏菌的异常繁殖,从而减低水环境迟缓爱德华氏菌对无鳞鱼体的攻击力;而相同剂量下,本发明复合植物提取物对同为肠杆菌科的大肠杆菌等无明显低浓度抑制作用,对弧菌科气单胞菌属的嗜水气单胞菌和对粘杆菌科的柱状黄杆菌等无明显抑制作用。从组方配伍方面看,本发明复合植物提取物由紫背草鲜叶提取物、马齿苋提取物和金不换茎提取物组成,三种成分具有显著的配伍增效作用,对养殖水体中迟缓爱德华氏菌具有良好的抑制作用,但对迟缓爱德华氏菌感染无鳞鱼表引发的局部褪色斑没有修复效果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

一种用于抑制水环境迟缓爱德华氏菌的复合植物提取物,以重量百分比计,称取紫背草鲜叶提取物56份、马齿苋提取物26份、金不换茎提取物18份,在28℃环境下,将上述各组分混合即可,所获得的混合液为所述复合植物提取物。

其中,上述紫背草鲜叶提取物由下述方法得到:

(1)紫背草鲜叶与食盐按质量百分比(1/100)混合并充分研磨成捣碎物,将捣碎物与陈醋溶液按质量体积比1:10混合,置于室温33-35℃环境中密闭混合8-10天,期间保持每3-4小时间隔搅拌4-5min,取出醋制紫背草鲜叶物;

(2)将醋制紫背草鲜叶物与水、乳酸菌液态培养基(重量体积比为8:22:5)和乳酸菌混合(乳酸菌的加入量为每质量份醋制紫背草鲜叶物加入5.5╳105cfu),33-37℃密闭培养至od值为7.0-7.5得到培养物,将培养物离心去渣,收集上清液,接着28℃条件下,将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.5mpa,超滤膜的膜通量以60l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积20%的浓缩液即为所述紫背草鲜叶提取物。

其中,马齿苋提取物由包含以下步骤的方法制备得到:将马齿苋、水、分枝杆菌液态培养基和分枝杆菌混合,35-40℃密闭培养至od值为4.0得到培养物,35℃条件下,过滤收集培养物中的经过发酵的马齿苋,置于在加温至85℃的热锅上与1/4-1/3质量份的复合盐混合炙炒30-50min,以复合盐完全溶化时收集含盐马齿苋,置于45℃条件下烘干至含水量≤8%,并与4质量份的水混合,分装密闭于121℃下高压灭菌15min,冷却后取出,离心去渣,接着在环境温度30℃条件下,将收集的上清液装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.5mpa,超滤膜的膜通量以60l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积18%的浓缩液,获得浓缩液即为所述的马齿苋提取物。其中,马齿苋:水:分枝杆菌液态培养基的重量体积比为1:10:3,分枝杆菌的加入量为每质量份马齿苋加入8╳106cfu。

其中,上述金不换茎提取物由包含以下步骤的方法制备得到:按重量份计,金不换茎100份,经过压榨收取金不换茎汁液,保留金不换茎压榨粕,将压榨后的金不换茎汁液,离心去上清,收集离心沉积物,将沉积物与芽孢菌、水、培养基充分发酵5-6天,取发酵离心去沉积,取离心上清液,标记为上清液a。将经过压榨的金不换茎粕用薄膜包裸封口,再经速冻、预膨化、真空脱油处理,获得金不换茎脱水干燥物,干燥物过60目筛进行粉碎,获得金不换茎粉碎物,将金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基和芽孢菌混合,38℃密闭培养至od值为6.5得到培养物,26℃条件下,过滤收集培养物,5000rpm离心25min,弃离心收集离心沉积物,并以离心沉积物的9倍质量份加水充分溶解,接着分装密闭,并于121℃下高压灭菌15min,冷却后取出,900rpm离心8min,去渣留离心上清液(标记为上清液b),接着在环境温度28℃条件下,将收集的上清液a和上清液b混合装入无搅拌式超滤装置,以操作压力为0.4mpa,超滤膜的膜通量以50l/m2·h为技术参数,所获得的浓缩至原体积20%的浓缩液,获得浓缩液即为所述的金不换茎提取物。其中,金不换茎粉碎物:水:芽孢液态培养基按重量体积比1:9:3进行混合,芽孢菌的加入量为每质量份金不换茎粉碎物加入6╳106cfu。

实验例1本发明复合植物提取物对常见水产致病菌的抑制作用比较

1、试验材料

1.1试验菌种

迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌:均由本课题组保存提供。

聚维酮碘:为含量10%的聚维酮碘溶液。

1.2试验耗材

tsb培养基、培养皿、试管、蒸馏水等若干。

1.3复合植物提取物

本实验所用的本发明所述复合植物提取物,其制备方法同实施例1。

2、试验方法

2.1菌悬液制备

将迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌接种于tsb营养肉汤中,30℃培养16-20h,离心收集菌体,通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法,用pbs将菌体稀释至1×104-5×104cfu/ml的菌悬液。

2.2复合植物提取物的配制

利用灭菌水将复合植物提取物稀释至试验浓度。

2.3mic测定与结果判定

将4.5ml的试验浓度复合植物提取物和0.5ml菌悬液混合均匀,以pbs替代消毒剂作为对照组,以pbs且不添加菌悬液作为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后,各组反应液分别取0.5ml转接到4.5ml新鲜肉汤中,30-35℃培养24h,观察结果。

若肉汤浑浊表示有菌生长,记为阳性(+),肉汤澄清表示无菌生长,记为阴性(-);对照组应该浑浊而空白组应该澄清。澄清的最低消毒剂浓度组的消毒剂浓度为该消毒剂的mic值。

2.4杀菌率测定与结果判定

将4.5ml的试验浓度复合植物提取物和0.5ml菌悬液混合均匀,以pbs替代消毒剂作为对照组,以pbs且不添加菌悬液做为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后,将各组反应液取100ul涂布,各组3个平行,30-35℃培养24h,计数杀菌率。

对照组菌数应100个以上,则菌悬液菌浓度达1×104-3×104cfu/ml;空白组应无菌生长;通过计算杀菌率评估消毒剂对细菌的杀灭效果:

杀菌率(%)=(对照组存活菌数-试验组存活菌数)×100/对照组存活菌数。

3、试验结果

表1试验数据表明,复合植物提取物对迟缓爱德华氏菌的mic为0.063-0.125mg/l,mic远远低于聚维酮碘对迟缓爱德华氏菌mic的2mg/l,同时其对嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌的mic则分别为8mg/l、4mg/l,则又分别低于聚维酮碘对嗜水气单胞菌mic4mg/l、柱状黄杆菌mic2mg/l。由此可见,本发明复合植物提取物对迟缓爱德华氏菌有良好的抑制作用,而对嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌的抑制作用则弱于聚维酮碘。

表1

表2试验数据表明,当复合植物提取物浓度为0.063mg/l,其对迟缓爱德华氏菌的杀菌率不稳定,最高时杀菌率可达100%,最低量杀菌率可达80%;当复合植物提取物浓度≥0.125mg/l时,其对迟缓爱德华氏菌的杀菌率超过100%;另一方面,当复合植物提取物浓度为2mg/l时,其对嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌的杀菌率均为0。

表2

实验例2本发明复合植物提取物组方配伍对迟缓爱德华氏菌的抑制作用

1、试验材料

1.1复合植物提取物的制备

本实验所用的本发明复合植物提取物,命名为a,其制备方法同实施例1。

1.2组方缺失的复合植物提取物的准备

以本发明所述的实施例1制备的复合植物提取物配方为基础,通过单组分缺失或双组方同时缺失或三组分同时缺失且缺失组分以pbs等量取代的技术思路,制备紫背草鲜叶提取物单一缺失的复合植物提取物、马齿苋提取物单一缺失的复合植物提取物、金不换茎提取物单一缺失的复合植物提取物,制备紫背草鲜叶提取物和马齿苋提取物同时缺失的复合植物提取物、紫背草鲜叶提取物和金不换茎提取物同时缺失的复合植物提取物、马齿苋提取物和金不换茎提取物同时缺失的复合植物提取物,上述制备的复合植物提取物依次命名为b、c、d、e、f、g。

以紫背草鲜叶、马齿苋和金不换茎与10倍质量体积比的蒸馏水混合,在文火中煮至1ml药液等同于1g原药重量即可,并将紫背草鲜叶水煮液、马齿苋水煮液和金不换茎水煮液命名为h、k、l,作为对照组。

2、试验方法

2.1菌悬液制备

同实验例1。

2.2复合植物提取物的配制

利用灭菌水将试验用复合植物提取物a、b、c、d、e、f、g、h、k、l分别稀释至试验浓度。

2.3mic测定与结果判定

将4.5ml的试验浓度复合植物提取物和0.5ml菌悬液混合均匀,以pbs替代消毒剂作为对照组,以pbs且不添加菌悬液作为空白组。将反应液置于20±2℃水浴锅中反应10min后,各组反应液分别取0.5ml转接到4.5ml新鲜肉汤中,30-35℃培养24h,观察结果。

若肉汤浑浊表示有菌生长,记为阳性(+),肉汤澄清表示无菌生长,记为阴性(-);对照组应该浑浊而空白组应该澄清。澄清的最低消毒剂浓度组的消毒剂浓度为该消毒剂的mic值。

3、试验结果

表3试验数据表明,复合植物提取物对迟缓爱德华氏菌的mic为0.63-0.125mg/l,聚维酮碘对迟缓爱德华氏菌mic的4mg/l,而紫背草鲜叶提取物、马齿苋提取物和金不换茎提取物单独组分对迟缓爱德华氏菌的mic远远高于本发明所述复合植物提取物的mic,这说明紫背草鲜叶提取物、马齿苋提取物、金不换茎提取物以单一组分存在时,相较于复合植物提取物而言,其对迟缓爱德华氏菌的抑制作用严重弱化。当复合植物提取物中紫背草鲜叶提取物单一缺失时,其对迟缓爱德华氏菌的mic上升至4mg/l;当复合植物提取物中马齿苋提取物缺失时、复合植物提取物中金不换茎提取物缺失时,这两者对迟缓爱德华氏菌mic均为1mg/l。当复合植物提取物中以双组分同时缺失时,其中以含有紫背草鲜叶提取物的其他两组分同时缺失的试验组、含有马齿苋提取物的其他两组分同时缺失的试验组均对迟缓爱德华氏菌的mic高于含有金不换茎提取物的其他两组分同时缺失的试验组,由可见,作为对迟缓爱德华氏菌具有良好抑制作用的本发明所述复合植物提取物,紫背草鲜叶提取物是复合植物提取物具有抑制迟缓爱德华氏菌的主要组分,而马齿苋提取物是次有效成分,金不换茎提取物复合植物提取物具有抑制迟缓爱德华氏菌的辅助增效组分。

而紫背草鲜叶水煮液、马齿苋水煮液和金不换茎水煮液三者单独使用对迟缓爱德华氏菌的mic为16mg/l、16mg/l、32mg/l。

表3

实验例3本发明复合植物提取物对不同深度水体的迟缓爱德华氏菌的抑制作用

1、试验水源

发生迟缓爱德华氏菌疾病且日亩均死亡率超1%的黄颡鱼塘口。

暴氯24h的自来水。

2、试验方法

2.1菌株的扩培

从种子批斜面上挑取迟缓爱德华氏菌菌落接种于tsb营养肉汤中,30℃摇床培养20-24h,离心收集菌体,通过麦氏比浊管将菌液进行比浊预估菌浓度的方法,用pbs将菌体稀释至1011cfu/ml的菌悬液,作为母液。

2.2定量带菌小水体环境模型的构建

将12个容积均为1立方米且高度为2米的水族箱固定在平整的地面上,分别命名为a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3、d1、d2、d3,其中a1、a2、a3设置为a系试验平行组,b1、b2、b3设置为b系试验平行组,c1、c2、c3设置为c系试验平行组,d1、d2、d3设置为d系试验平行组,各个试验组以及试验所用到的耗材全部利用二氧化氯喷雾彻底消毒,各水族箱预装暴氯24h的等温灭菌自来水,水深均为1.5米,置于装置有紫外线灭菌的室内环境。

在25-28℃环境温度下,向各系试验平行组分别加入迟缓爱德华氏菌悬液,直到a、b、c、d系试验平行组各组水体迟缓爱德华氏菌含量为104cfu/l,持续供氧,维持试验水体溶氧含量全程不低于7mg/l。完成上述试验操作,即视为定量带菌小水体环境模型构建成功。

其中,以距离上层水面20公分的容积区域定义为水环境上层,以水族箱水位中线为界面向上与向下等量扩展共20公分的容积区域定义为水环境中层,以底层水面向上20公分的容积区域定义为水环境下层。

2.3单用本发明复合植物提取物对带菌水环境不同深度的抑菌效果测试

在25-28℃环境温度下,选择a、b、c系试验平行组,造模成功后,通过箱壁固定的方式,在水族箱水环境上层、中层和下层装引水管,静置2h,向a系试验平行组加入本发明复合植物提取物直至终浓度为0.125ppm,b系试验平行组加入聚维酮碘直至终浓度为2ppm,c系试验平行组不加入任何物质,设为空白对照组。

分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h,通过引水管从各个平行组抽取水环境上层、中层和下层水样1ml,其中水环境上层水样1ml视为一个水样,1个水样稀释2-4倍,从1个水样2倍稀释液中取100μl滴加并涂布到一个平皿上,静置5min,每个水样做3个平行,所有涂布水样的平皿置于35℃培养箱中培养20-24h,观察并记录平皿上迟缓爱德华氏菌的菌落数量。

菌落计数结果判断标准如下:计数时应选取菌落数在30-300之间的平板,若有两个稀释度均在30-300之间时,按国家标准方法要求应以二者比值决定,比值小于或等于2取平均数,比值大于2则取其较小数字,公式如下:

每个原始水样的含菌浓度=稀释倍数×该稀释倍数下对应平皿的菌落计数;

若菌落数低于30,则据实统计记录。

2.4本发明复合植物提取物联用活性物质对带菌水环境不同深度的抑菌效果测试

在25-28℃环境温度下,选择a、c、d系试验平行组,其中a和c组与试验2.3共享试验组,造模成功后,通过箱壁固定的方式,在水族箱水环境上层、中层和下层装引水管,静置2h,向a系试验平行组加入本发明复合植物提取物直至终浓度为0.125ppm,d系试验平行组加入本发明复合植物提取物与高分子阴离子聚合物,复配浓度为0.125ppm和0.2ppm,c系试验平行组不加入任何物质,设为空白对照组。

分别于1h、2h、4h、8h、16h、32h、64h,通过引水管从各个平行组抽取水环境上层、中层和下层水样1ml,其中水环境上层水样1ml视为一个水样,1个水样稀释2-4倍,从1个水样2倍稀释液中取100μl滴加并涂布到一个平皿上,静置5min,每个水样做3个平行,所有涂布水样的平皿置于35℃培养箱中培养20-24h,观察并记录平皿上迟缓爱德华氏菌的菌落数量。

菌落计数结果判断标准如下:同上。

3、试验结果

3.1单用本发明复合植物提取物对带菌水环境不同深度的抑菌效果

如表4,带菌水环境造模成功后,不添加任何消毒剂的c系试验组,其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中迟缓爱德华氏菌含量都保持增长,而且不同时间点,上层、中层和下层水体中的含量数量都比较接近。与空白对照组相比,添加了聚维酮碘的b系试验组,其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中迟缓爱德华氏菌含量都呈明显下降,而且不同水层水体中迟缓爱德华氏菌的含量都比较接近,说明2ppm的聚维酮碘溶液对水体的迟缓爱德华氏菌有较好的抑制作用,但仍达不到完全抑制迟缓爱德华氏菌的效果,且从添加了聚维酮碘的32-64h期间,水环境上层、中层和下层水体的迟缓爱德华氏菌出现相较于前16h时的含量有一定的上升。添加了本发明复合植物提取物的b系试验组,其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中迟缓爱德华氏菌含量呈极明显的下降;其中1-16h阶段,本发明复合植物提取物使用后,对上层和中层水体的迟缓爱德华氏菌具有完全抑制效果,而对下层水体的迟缓爱德华氏菌具有一定的抑制效果,其效果明显优于添加了聚维酮碘的b系试验组;32-64h阶段,水环境上层、中层和下层水体的迟缓爱德华氏菌出现相较于前16h时的含量也仅是轻微上升。

综上所述,本发明复合植物提取物对水环境不同深度水体迟缓爱德华氏菌具有明显的抑制作用,且以对上层和中层水体迟缓爱德华氏菌的抑制效果更优,也远优于以高于本发明复合植物提取物15倍浓度的聚维酮碘试验组。

表4

3.2发明复合植物提取物联用活性物质对带菌水环境不同深度的抑菌效果

如下表5,带菌水环境造模成功后,不添加任何消毒剂的c系试验组,其水体不同时间点水环境上层、中层和下层水体中迟缓爱德华氏菌含量都保持增长,而且不同时间点,上层、中层和下层水体中的含量数量都比较接近。与空白对照组相比,添加了本发明复合植物提取物复配聚合物的d系试验组,其水体不同时间点水环境上层、中层水体中迟缓爱德华氏菌含量呈极明显的下降;其中1-16h阶段,本发明复合植物提取物使用后,对上层、中层水体的迟缓爱德华氏菌具有完全抑制效果,而对下层水体的迟缓爱德华氏菌抑制效果则与聚合物的沉降位置有关,值得指出的是,本发明复合植物提取物复配聚合物联用,起始的前2h可降低至造模时的5%及以下菌含量水平,当聚合完全沉降至底部时,4-16h阶段,本发明复合植物提取物复配聚合物联用则表现为对下层水迟缓爱德华氏菌的完全抑制;32-64h阶段,水环境上层、中层和下层水体的迟缓爱德华氏菌出现相较于前16h时的含量也仅是轻微上升。相较于添加了本发明复合植物提取物的b系试验组,聚合物的复配使用,可增强本发明复合物对中层和下层水体迟缓爱德华氏菌的完全抑制作用。

综上所述,本发明复合植物提取物对水环境不同深度水体迟缓爱德华氏菌具有明显的抑制作用,复配聚合物使用,可以增强本发明复合植物提取物对中层和下层水体迟缓爱德华氏菌的完全抑制效果及持续抑制的时间。

表5

实验例4本发明复合植物提取物对迟缓爱德华氏菌源性体表褪色斑的修复作用

1、试验材料

1.1试验黄颡鱼:规格为20±3g/尾,体表无任何可见的异常病理症状,同批鱼群3%比例黄颡鱼随机抽检剖解未发现内脏任何可见的异常病理症状。

2、试验方法

2.1菌株的扩培:同实验例3。

2.2试验鱼体外浸泡感染模型的构建

试验第1天,从准备用于本次试验的生鱼中随机捞取600尾,经检测体表、口腔、鳍条无任何肉眼可见的异常病理症状,视为符合本次感染模型构建的试验鱼使用要求。将600尾试验生鱼随机平均分配到12个预装300l暴氯24h的自来水的的水族箱中,每个水族箱用鱼50尾,这12个水族箱分别命名a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3、d1、d2、d3,静养12-18h,向各水族箱加入去垢剂十二烷基磺酸钠直至其终质量浓度为0.2%,当各个水族箱的试验鱼浸泡5分钟后,试验鱼体表变性的粘液开始呈现局部性脱落,将各个水族箱中的水全部换为加氧暴氯24h的等温自来水,静养2-3h,依次向12个水族箱加入迟缓爱德华氏菌母液,直至各个水族箱中迟缓爱德华氏菌的终含量为104cfu/l,36-48h期间,观察各水族箱生鱼体表、鳍条和口腔的出现红点的数量,若各水族箱中生鱼体表、鳍条和口腔出现红点的鱼体尾数比例大于10%,且各水族箱中体表、鳍条和口腔出现红点的生鱼其红点病灶数量不低于2处,视为体外浸泡感染模型构建成功。

试验期间持续加氧保持各水族箱水体温度为28-30℃,水体溶氧含量不低于7mg/l,不投饲料。其中a1、a2、a3设置为a系试验平行组,b1、b2、b3设置为b系试验平行组,c1、c2、c3设置为c系试验平行组,d1、d2、d3设置为d系试验平行组。

2.3复合植物提取物对生鱼体外感染造成的红点的修复作用

试验第48h起,按0.195ppm、0.39ppm的终浓度依次向a系(a1、a2、a3)、b系(b1、b2、b3)加入本发明复合植物提取物,按2ppm终浓度依次向c系(c1、c2、c3)加入聚维酮碘,d系(d1、d2、d3)设置为空白对照组,其对应的水族箱不加入任何消毒剂。各试验组和空白对照组保持12h不换水,随后将各个水族箱中的水全部换为加氧暴氯24h的等温自来水,48h观察鱼体褪色斑区域是否停止扩散,以此来判断复合植物提取物对黄颡鱼体外感染造成的褪色斑的修复作用,其效果判断标准如下:

褪色斑修复:以单尾出现褪色斑的黄颡鱼计,当单尾黄颡鱼的褪色斑全部转归正常时,若出现在消毒剂处理组,则视为本组添加的物质具有抑制迟缓爱德华氏菌感染扩散的作用;若出现在空白组,则视为鱼体自愈作用。

注:上述公式中,x代表a系、b系、c系;黄颡鱼褪色斑的总数量;初始褪色斑数代表对照组造模成功时统计的该组出现褪色斑总数;

3、试验结果

3.1试验鱼体外浸泡感染模型的构建结果

如下表6,各组试验黄颡鱼体表出现褪色斑的比例分别为15.3%、16.7%、16.0%和14.7%,且各出现褪色斑的试验黄颡鱼其体表褪色斑病灶数量均大于或等于2处。由此可见,本次试验黄颡鱼体外浸泡感染模型构建成功,可以作为下一步评估不同物质对褪色斑修复作用的病理模型。

表6

3.2各组黄颡鱼体外感染造成的红点的修复结果

如下表7,相同试验条件下,自造模成功后,48h后观察发现:空白对照组没有使用任何消毒剂,出现褪色斑的试验黄颡鱼体表褪色斑病灶呈现明显向外扩散的病变趋势;浸泡于2ppm聚维酮碘的试验黄颡鱼,出现褪色斑的试验黄颡鱼体表褪色斑病灶修复率仅3.5%;浸泡于0.125ppm和0.25ppm复合植物提取物的试验黄颡鱼,出现褪色斑的试验黄颡鱼体表褪色斑病灶修复率分别仅为52.4%和52.3%;由此可见,浸泡于0.125ppm和0.25ppm复合植物提取物的试验黄颡鱼浸泡于,出现褪色斑的试验黄颡鱼体表褪色斑病灶修复程度优于对照组和聚酮碘组,但仍然达不到60%以上的褪色斑修复率。

表7

注:*代表鱼体自愈率。

实验例5本发明复合植物提取物对水产动物的安全性评估

1、试验材料与方法

1.1复合植物提取物的制备

本实验所用的本发明所述复合植物提取物,其制备方法同实施例1。

1.2试验鱼的暂养与分组

选择健康黄颡鱼600尾,分成6个组,每个组100尾,每个组下设两个平行组,每个平行组50尾,分别随机命名为a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2、e1、e2、f1、f2。

选择健康斑点叉尾鮰600尾,分成6个组,每个组100尾,每个组下设两个平行组,每个平行组50尾,分别随机命名为h1、h2、j1、j2、k1、k2、l1、l2、m1、m2、n1、n2。

选择健康沟鲇600尾,分成6个组,每个组100尾,每个组下设两个平行组,每个平行组50尾,分别随机命名为p1、p2、q1、q2、r1、r2、s1、s2、t1、t2、v1、v2。

1.3复合植物提取物梯度浓度的配制与安全性评估

取本发明复合植物提取物溶,按0、0.625ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的终浓度要求,其对应的试验组分配如下表8。

表8

在0、12h、24h三个时间维度下,分别评估终浓度为0、0.625ppm、1.25ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm的试验水体中,各个试验组试验鱼的存活情况,并通过以下公式评估复合植物提取物对不同试验鱼的安全性。

1.4其他耗材

蒸馏水若干,量杯适量。

2、试验结果

如下表9,不同时间点的安全性评估结果表明,复合植物提取物对黄颡鱼、斑点叉尾鮰和沟鲇的安全浓度为≤2.5mg/l。当使用终浓度为5-10mg/l时,复合植物提取物对黄颡鱼的安全性优于对斑点叉尾鮰和沟鲇的。

表9

综合试验例1-5试验结果可知,本发明复合植物提取物在合适的使用剂量下,可有效抑制养殖水体中迟缓爱德华氏菌的异常繁殖,降低其感染鱼体的风险;若复配具有沉降作用的聚合物使用,可以更进一步增强复合植物提取物对中层和下层水体迟缓爱德华氏菌的抑制作用;同时对因感染迟缓爱德华氏菌引发体表褪色斑具有约50%的修复效果,生产应用中利用本发明复合植物物低剂量快速起效的特点,可以在疾病流行前期做好水体对迟缓爱德华氏菌的消毒抑菌操作,从而降低因该菌在水体含量过高而引起体表病变导致损失的风险,应用价值十分清晰。

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