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表达识别脂壳寡糖的异源受体的基因改变的植物的制作方法

文档序号:24891599发布日期:2021-04-30 13:18
表达识别脂壳寡糖的异源受体的基因改变的植物的制作方法

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本公开涉及基因改变的植物。具体地,本公开涉及含有编码异源受体多肽的核酸序列的基因改变的植物。植物能够通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。



背景技术:

植物在其环境中暴露于良性和病原性的各种微生物。为了防御病原性微生物,植物具有通过大量受体识别微生物的特定分子信号的能力,并且取决于信号的模式,可启动适当的免疫应答。分子信号源自微生物的分泌材料、细胞壁组分和甚至胞质蛋白。壳寡糖(co)是植物通过质膜上发现的几丁质受体cebip和cerk1识别的重要的真菌分子信号。这些受体在lysm类别的受体中,并且识别来自真菌的co的尺寸和乙酰化。脂壳寡糖(lco)是由细菌和真菌产生的另一重要的分子信号,其被其他lysm受体识别。

除了良性和病原性微生物外,一些微生物可通过缔合或共生对植物有益。与某些固氮细菌和真菌进入共生关系的植物需要能够识别特定的细菌或真菌物种以启动共生,同时仍能够激活其免疫系统以对其他细菌和真菌做出答应。允许植物来识别这些特定的细菌或真菌的一种重要机制是通过特化的lysm受体,其对特定的细菌或真菌产生的lco形式具有高亲和性和高选择性,而来自其他细菌和真菌的lco不被这些特化的lysm受体识别。

使用突变体植物和表型输出的功能研究已经用于鉴定这些特化的lysm受体。然而,目前,仅已经在实验上鉴定了来自有限数量的植物物种并且能够识别有限数量的潜在共生体的少数高亲和性和高选择性的lysm受体。由于这些受体是识别共生细菌和真菌物种以及启动共生所必需的,因此重要的是有更多可得到的受体可以用于工程化对另外的共生细菌和真菌物种的识别。需要更广泛的受体用于工程化目前不能形成共生关系的植物中的共生以及用于优化能够形成共生关系的植物中的共生。



技术实现要素:

为了工程化植物-微生物共生关系,明显需要另外的特化的lysm受体。因此,本公开提供了允许植物识别由细菌或真菌物种产生的脂壳寡糖(lco)的多种新的高亲和性和高选择性lysm受体。

本公开的某些方面涉及含有编码异源受体多肽的核酸序列的基因改变的植物或植物部分,其中异源受体多肽选自下述的组中:与seqidno:5[鹰嘴豆/鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第一多肽,与seqidno:7[菜豆/菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第二多肽,与seqidno:9[花生/花生属(arachis)nfr5]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第三多肽,与seqidno:11[莲属(lotus)lys11]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第四多肽,与seqidno:12[苜蓿属(medicago)lyr1]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第五多肽,与seqidno:13[拟山黄麻属(parasponia)nfp1]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第六多肽,与seqidno:16[大麦hvlysm-rlk1(ak370300)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第七多肽,与seqidno:17[大麦hvlysm-rlk2(ak357612)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第八多肽,与seqidno:18[大麦hvlysm-rlk3ak372128]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第九多肽,与seqidno:19[大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十多肽,与seqidno:20[玉蜀黍zm1(xp_020399958)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十一多肽,与seqidno:21[玉蜀黍zm5(xp_008652982.1)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十二多肽,与seqidno:22[苹果nfp5xp_008338966.1]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十三多肽或与seqidno:23[草莓nfr5xp_004300586.2]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十四多肽。在一些实施方式中,异源受体多肽选自下述的组中:seqidno:5[鹰嘴豆/鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5]、seqidno:7[菜豆/菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5]、seqidno:9[花生/花生属(arachis)nfr5]、seqidno:11[莲属(lotus)lys11]、seqidno:12[苜蓿属(medicago)lyr1]、seqidno:13[拟山黄麻属(parasponia)nfp1]、seqidno:16[大麦hvlysm-rlk1(ak370300)]、seqidno:17[大麦hvlysm-rlk2(ak357612)]、seqidno:18[大麦hvlysm-rlk3ak372128]、seqidno:19[大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170)]、seqidno:20[玉蜀黍zm1(xp_020399958)]、seqidno:21[玉蜀黍zm5(xp_008652982.1)]、seqidno:22[苹果nfp5xp_008338966.1]和seqidno:23[草莓nfr5xp_004300586.2]。在一些实施方式中,异源受体多肽的表达允许植物或其部分通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。在一些实施方式中,lco由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中,lco由选自下述的组中的固氮菌产生:百脉根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)、华癸中慢生根瘤菌(mesorhizobiumhuakuii)、地中海中慢生根瘤菌(mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(rhizobiumetliphaseoli)、贾氏根瘤菌(rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(r.leguminosarumtrifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumviciae)和菜豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、药用中华根瘤菌(sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)ngr234、茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobiumcaulinodans)、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobiumelkanii)、辽参慢生根瘤菌(bradyrhizobiumliaonginense)、根瘤菌属(rhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、中华根瘤菌属(sinorhizobium)物种、固氮根瘤菌属(azorhizobium)物种、弗兰克氏菌属(frankia)物种或其任何组合,或由选自下述的组中的菌根真菌产生:无柄孢子科(acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(gigasporaceae)物种、平囊霉科(pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(funneliformis)物种、球囊霉属(glomus)物种、球囊霉属(rhizophagus)物种、硬囊霉属(sclerocystis)物种、septoglomus属物种、claroideoglomus属物种、ambispora属物种、原囊霉属(archaeospora)物种、geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(paraglomus)属物种、球囊霉门(glomeromycota)中的其他物种或其任何组合。在一些实施方式中,异源多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中,植物细胞是根细胞。在一些实施方式中,根细胞是根表皮细胞或根皮质细胞。在一些实施方式中,异源多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属(lotus)nfr5启动子(seqidno:24)和莲属(lotus)nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,植物选自下述的组中:玉米(例如,玉蜀黍、玉米(zeamays)),水稻(例如,亚洲栽培稻(oryzasativa)、非洲栽培稻(oryzaglaberrima)、菰属(zizania)物种,大麦(例如,大麦(hordeumvulgare),小麦(例如,普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(triticumaestivum)、斯卑尔脱小麦(triticumspelta)、硬粒小麦(triticumdurum)、小麦属(triticum)物种),山黄麻属(trema)物种(例如,光叶山黄麻(tremacannabina)、tremacubense、tremadiscolor、tremadomingensis、tremaintegerrima、tremalamarckiana、小花山黄麻(tremamicrantha)、异色山黄麻(tremaorientalis)、tremaphilippinensis、tremastrigilosa、山黄麻(trematomentosa)),苹果(例如,西洋苹果(maluspumila),梨(例如,西洋梨(pyruscommunis)、白梨(pyrus×bretschneideri)、沙梨(pyruspyrifolia)、新疆梨(pyrussinkiangensis)、川梨(pyruspashia)、梨属(pyrus)物种),李子(例如,西梅、西洋李子,布拉斯李、欧洲李(prunusdomestica)、中国李(prunussalicina)),杏子(例如,山杏(prunusarmeniaca)、布里扬松杏(prunusbrigantina)、东北杏(prunusmandshurica)、梅(prunusmume)、西伯利亚杏(prunussibirica)),桃子(例如,油桃、桃(prunuspersica),扁桃(例如,甜扁桃(prunusdulcis)、扁桃(prunusamygdalus)),胡桃(例如,波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(juglansregia)、黑胡桃(juglansnigra)、白胡桃(juglanscinerea)、加州胡桃(juglanscalifornica)),草莓(例如,草莓(fragaria×ananassa)、智利草莓(fragariachiloensis)、弗州草莓(fragariavirginiana)、野草莓(fragariavesca)),树莓(例如,欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(rubusidaeus)、美国黑树莓(rubusoccidentalis)、硬毛树莓(rubusstrigosus)),黑莓(例如,常青黑莓,喜马拉雅黑莓、黑莓(rubusfruticosus)、北美黑莓(rubusursinus)、裂叶黑莓(rubuslaciniatus)、尖齿黑莓(rubusargutus)、亚美尼亚黑莓(rubusarmeniacus)、露莓(rubusplicatus)、榆叶黑莓(rubusulmifolius)、美国黑莓(rubusallegheniensis)),红醋栗(例如,红丛茶蔍子(ribesrubrum)、红茶藨子(ribesspicatum)、高山茶藨子(ribesbesalpinum)、ribesschlechtendalii、多花茶藨子(ribesmultiflorum)、岩生茶藨子(ribespetraeum)、伏生茶藨子(ribestriste)),黑醋栗(例如,黑茶藨子(ribesnigrum),甜瓜(例如,西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(citrulluslanatus)、冬瓜(benincasahispida)、罗马甜瓜(cucumismelocantalupensis)、冬甜瓜(cucumismeloinodorus)、网纹甜瓜(cucumismeloreticulatus)),黄瓜(例如,切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(cucumissativus)),南瓜(例如,美国南瓜(cucurbitapepo)、笋瓜(cucurbitamaxima)),倭瓜(例如,葫芦、西葫芦(cucurbitaargyrosperma)、黑子南瓜(cucurbitaficifolia)、笋瓜(cucurbitamaxima)、中国南瓜(cucurbitamoschata)),葡萄(例如,葡萄(vitisvinifera)、山葡萄(vitisamurensis)、美洲葡萄(vitislabrusca)、白亮葡萄(vitismustangensis)、河岸葡萄(vitisriparia)、圆叶葡萄(vitisrotundifolia))或大麻(例如,印度大麻、大麻(cannabissativa))。

在任何以上实施方式的一些实施方式中:植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。在一些实施方式中,部分是果实、核或谷粒。

在一些方面中,本公开涉及任何以上实施方式的基因改变的植物的花粉粒或胚珠。

在一些方面中,本公开涉及从任何以上实施方式的植物产生的原生质体。

在一些方面中,本公开涉及从来自任何以上实施方式的植物的原生质体或细胞产生的组织培养物,其中细胞或原生质体从选自由下述组成的组中的植物部分产生:叶、花药、雌蕊、茎、叶柄、根、根原基、根尖、果实、种子、花、子叶、下胚轴、胚胎和分生组织细胞。

本公开的某些方面涉及产生任何以上实施方式的基因改变的植物的方法,其包括将基因改变引入包括核酸序列的植物。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,核酸序列被插入植物的基因组,以便核酸序列可操作地连接至内源启动子。在一些实施方式中,内源启动子是根特异性启动子。

在一些方面中,本公开涉及含有编码异源受体多肽的核酸序列的基因改变的植物种子,其中异源受体多肽选自下述的组中:与seqidno:5[鹰嘴豆/鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第一多肽,与seqidno:7[菜豆/菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第二多肽,与seqidno:9[花生/花生属(arachis)nfr5]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第三多肽,与seqidno:11[莲属(lotus)lys11]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第四多肽,与seqidno:12[苜蓿属(medicago)lyr1]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第五多肽,与seqidno:13[拟山黄麻属(parasponia)nfp1]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第六多肽,与seqidno:16[大麦hvlysm-rlk1(ak370300)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第七多肽,与seqidno:17[大麦hvlysm-rlk2(ak357612)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第八多肽,与seqidno:18[大麦hvlysm-rlk3ak372128]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第九多肽,与seqidno:19[大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十多肽,与seqidno:20[玉蜀黍zm1(xp_020399958)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十一多肽,与seqidno:21[玉蜀黍zm5(xp_008652982.1)]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十二多肽,与seqidno:22[苹果nfp5xp_008338966.1]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十三多肽或与seqidno:23[草莓nfr5xp_004300586.2]具有至少70%序列同一性、至少75%序列同一性、至少80%序列同一性、至少85%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少96%序列同一性、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性或至少99%序列同一性的第十四多肽。在一些实施方式中,异源受体多肽选自下述的组中:seqidno:5[鹰嘴豆/鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5]、seqidno:7[菜豆/菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5]、seqidno:9[花生/花生属(arachis)nfr5]、seqidno:11[莲属(lotus)lys11]、seqidno:12[苜蓿属(medicago)lyr1]、seqidno:13[拟山黄麻属(parasponia)nfp1]、seqidno:16[大麦hvlysm-rlk1(ak370300)]、seqidno:17[大麦hvlysm-rlk2(ak357612)]、seqidno:18[大麦hvlysm-rlk3ak372128]、seqidno:19[大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170)]、seqidno:20[玉蜀黍zm1(xp_020399958)]、seqidno:21[玉蜀黍zm5(xp_008652982.1)]、seqidno:22[苹果nfp5xp_008338966.1]或seqidno:23[草莓nfr5

xp_004300586.2]。在一些实施方式中,异源受体多肽的表达允许植物或其部分通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。在一些实施方式中,lco由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中,lco由选自下述的组中的固氮菌产生:百脉根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)、华癸中慢生根瘤菌(mesorhizobiumhuakuii)、地中海中慢生根瘤菌(mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(rhizobiumetliphaseoli)、贾氏根瘤菌(rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(r.leguminosarumtrifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumviciae)和菜豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、药用中华根瘤菌(sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)ngr234、茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobiumcaulinodans)、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobiumelkanii)、辽参慢生根瘤菌(bradyrhizobiumliaonginense)、根瘤菌属(rhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、中华根瘤菌属(sinorhizobium)物种、固氮根瘤菌属(azorhizobium)物种、弗兰克氏菌属(frankia)物种或其任何组合,或由选自下述的组中的菌根真菌产生:无柄孢子科(acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(gigasporaceae)物种、平囊霉科(pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(funneliformis)物种、球囊霉属(glomus)物种、球囊霉属(rhizophagus)物种、硬囊霉属(sclerocystis)物种、septoglomus属物种、claroideoglomus属物种、ambispora属物种、原囊霉属(archaeospora)物种、geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(paraglomus)属物种、球囊霉门(glomeromycota)中的其他物种或其任何组合。在一些实施方式中,当种子生长为植物时,异源多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中,植物细胞是根细胞。在一些实施方式中,根细胞是根表皮细胞或根皮质细胞。在一些实施方式中,当种子生长为植物时,异源多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,植物选自下述的组中:玉米(例如,玉蜀黍、玉米(zeamays)),水稻(例如,亚洲栽培稻(oryzasativa)、非洲栽培稻(oryzaglaberrima)、菰属(zizania)物种,大麦(例如,大麦(hordeumvulgare),小麦(例如,普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(triticumaestivum)、斯卑尔脱小麦(triticumspelta)、硬粒小麦(triticumdurum)、小麦属(triticum)物种),山黄麻属(trema)物种(例如,光叶山黄麻(tremacannabina)、tremacubense、tremadiscolor、tremadomingensis、tremaintegerrima、tremalamarckiana、小花山黄麻(tremamicrantha)、异色山黄麻(tremaorientalis)、tremaphilippinensis、tremastrigilosa、山黄麻(trematomentosa)),苹果(例如,西洋苹果(maluspumila),梨(例如,西洋梨(pyruscommunis)、白梨(pyrus×bretschneideri)、沙梨(pyruspyrifolia)、新疆梨(pyrussinkiangensis)、川梨(pyruspashia)、梨属(pyrus)物种),李子(例如,西梅、西洋李子,布拉斯李、欧洲李(prunusdomestica)、中国李(prunussalicina)),杏子(例如,山杏(prunusarmeniaca)、布里扬松杏(prunusbrigantina)、东北杏(prunusmandshurica)、梅(prunusmume)、西伯利亚杏(prunussibirica)),桃子(例如,油桃、桃(prunuspersica),扁桃(例如,甜扁桃(prunusdulcis)、扁桃(prunusamygdalus)),胡桃(例如,波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(juglansregia)、黑胡桃(juglansnigra)、白胡桃(juglanscinerea)、加州胡桃(juglanscalifornica)),草莓(例如,草莓(fragaria×ananassa)、智利草莓(fragariachiloensis)、弗州草莓(fragariavirginiana)、野草莓(fragariavesca)),树莓(例如,欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(rubusidaeus)、美国黑树莓(rubusoccidentalis)、硬毛树莓(rubusstrigosus)),黑莓(例如,常青黑莓,喜马拉雅黑莓、黑莓(rubusfruticosus)、北美黑莓(rubusursinus)、裂叶黑莓(rubuslaciniatus)、尖齿黑莓(rubusargutus)、亚美尼亚黑莓(rubusarmeniacus)、露莓(rubusplicatus)、榆叶黑莓(rubusulmifolius)、美国黑莓(rubusallegheniensis)),红醋栗(例如,红丛茶蔍子(ribesrubrum)、红茶藨子(ribesspicatum)、高山茶藨子(ribesbesalpinum)、ribesschlechtendalii、多花茶藨子(ribesmultiflorum)、岩生茶藨子(ribespetraeum)、伏生茶藨子(ribestriste)),黑醋栗(例如,黑茶藨子(ribesnigrum),甜瓜(例如,西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(citrulluslanatus)、冬瓜(benincasahispida)、罗马甜瓜(cucumismelocantalupensis)、冬甜瓜(cucumismeloinodorus)、网纹甜瓜(cucumismeloreticulatus)),黄瓜(例如,切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(cucumissativus)),南瓜(例如,美国南瓜(cucurbitapepo)、笋瓜(cucurbitamaxima)),倭瓜(例如,葫芦、西葫芦(cucurbitaargyrosperma)、黑子南瓜(cucurbitaficifolia)、笋瓜(cucurbitamaxima)、中国南瓜(cucurbitamoschata)),葡萄(例如,葡萄(vitisvinifera)、山葡萄(vitisamurensis)、美洲葡萄(vitislabrusca)、白亮葡萄(vitismustangensis)、河岸葡萄(vitisriparia)、圆叶葡萄(vitisrotundifolia))或大麻(例如,印度大麻、大麻(cannabissativa))。

在一些方面中,本公开涉及从以上实施方式的任何一项的基因改变的植物种子产生的植物,其中植物表达异源多肽,并且其中异源多肽的表达允许植物通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。

附图说明

图1a-1b显示nfp受体胞外域(nfp-ecd)的结构。图1a显示具有标记的三个lysm结构域(lysm1、lysm2和lysm3)的nfp-ecd。lysm结构域内的基序也被标记:lysm1基序=α1、α2、β1和β2;lysm2基序=α3、α4、β3和β4;和lysm3基序=α5、α6、β5和β6。显示了糖基化(二glcnac核心(上方处来自α1的突出;邻近β2和β1的中心处以及在α4的左下方处可见的另外核心),并且二硫桥用箭头指示且用残基数标记(c47-c166、c39-c104和c102-c164)。图1b显示示出受体的刚性柄区域的nfp-ecd的saxs包膜。整体尺寸以埃显示。

图2a-2b显示使用苜蓿中华根瘤菌lco-iv和lco-v以及百脉根中慢生根瘤菌lco-v和co6的生物层干涉法(bli)结合曲线。图2a显示nfp以26±0.2μm的平均kd结合苜蓿中华根瘤菌lco-iv(苜蓿中华根瘤菌nod-lco-iv),和nfp以32±0.2μm的平均kd结合苜蓿中华根瘤菌lco-v(苜蓿中华根瘤菌nod-lco-v)。图2a中显示的结果来自七次重复。图2b显示nfp不结合百脉根中慢生根瘤菌lco-v(百脉根中慢生根瘤菌nod-lco-v)和百脉根中慢生根瘤菌co6。图2b中显示的结果来自六次重复。

图3a-3b显示苜蓿中华根瘤菌lco-iv突变体,和使用这些变体的结合测定的结果。图3a显示具有箭头的苜蓿中华根瘤菌lco-iv突变体的示意图,箭头指示四个突变nodl、nodh、nodfe和nodfl的每一个在lco-iv中影响的位置。图3b显示使用三lco-iv突变体并且苜蓿中华根瘤菌lco-iv作为对照进行的结合测定。lco-iv显示的结果来自七次重复、nodh(苜蓿中华根瘤菌δh)显示的结果来自四次重复、nodfe(苜蓿中华根瘤菌δfe)显示的结果来自三次重复和nodfl(苜蓿中华根瘤菌δfl)显示的结果来自三次重复。

图4a-4b显示苜蓿属nfplysm2结构域中的疏水补丁以及使用疏水补丁内重要残基的突变体的结合测定测量。图4a显示将co4(命名为“配体”)分子对接至用静电表面电势遮蔽住的苜蓿属nfp。由黑色虚线圈出疏水补丁,且使用箭头显示了重要残基l147和l154的位置。用灰色虚线描绘了lco脂肪酸的位置。图4b显示比较野生型(wt)nfp(“nfpwt”)与在残基147和154(“nfpl147dl154d”;粗体)处突变的nfp的结合测定测量。nfpwt显示的结果来自七次重复和nfpl147dl154d显示的结果来自四次重复。

图5显示用于突变体互补实验的构建体的总体示意图。命名如下:t-dna左边界序列=lb,t-dna右边界序列=rb,β-葡糖醛酸酶基因=gus,缓冲区序列=缓冲剂,早期结瘤素-11前体启动子=penod11,nfp启动子=pnfp。箭头指示基因转录的方向。

图6a-6b显示苜蓿属nfp突变体的互补试验。图6a显示用苜蓿中华根瘤菌菌株2011接种所测试的互补;柱表示49dpi后的平均结节数。图6b显示用药用中华根瘤菌接种测试的互补;柱表示28dpi后的平均结节数。对于图6a-6b,圆圈表示个体计数;空的圆圈=苜蓿jemalong野生型背景(wt);实心圆圈=苜蓿属nfp突变体背景(nfp);evc=空的载体对照;wt=野生型nfp对照;误差线显示sem;不同字母指示样品之间的显著差异(anova,tukey,p<0.05);和x-轴上括号中的标记指示测定的植物的数量。

图7a-7g显示其他lco受体胞外域的同源性建模,具有根据其静电电势遮蔽住的不同lco受体的表面描绘。当存在时,由黑色虚线圈出疏水补丁和由灰色虚线圈出阴性补丁。对接的配体(几丁质)作为引导显示。图7a显示其他表征的lco受体:莲属nfr5、豌豆(豌豆(pisumsativum))sym10和大豆(大豆(glycinemax))nfr5α的同源性建模。图7b显示具有疏水补丁的鹰嘴豆(鹰嘴豆(cicerarietinum))nfr5、菜豆(菜豆(phaseolusvulgaris))nfr5和花生(花生(arachishypogaea))nfr5中的之前未表征的lco受体同系物的同源性建模。图7c-7e显示更远缘相关受体的同源性建模,包括(图7c)lys受体:lys11、lys12、lys13、lys14、lys15、lys16、lys17和lys18;(图7d)lyr受体:lyr1、lyr2、lyr3和lyr4以及(图7e)nfp受体:拟山黄麻(parasponia)nfp1和拟山黄麻(parasponia)nfp2。图7f显示不具有疏水补丁的苜蓿属lyr3和莲属lys12受体的模型(从lysm3结构域和具有对接的配体(几丁质)观察的模型)。图7g显示莲属lys11模型(lys11–模型;左;还在图7c中)与莲属lys11的晶体结构(lys11–晶体结构;右)的比较。

图8a-8c显示从以下选择的lysm受体的比对:拟南芥(at;at3g21630_cerk1(seqidno:37)、at1g77630_lyp3(seqidno:42)、at2g17120_lyp1(seqidno:44))、玉米(zeamays)(zm;zm9_np_001146346.1(seqidno:34))、大麦(hordeumvulgare)(hv;hvlysmrlk4_ak369594.1(seqidno:35))、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)(mt或medtr;mt_lyk9_xp_003601376(seqidno:31)、mt_lyk3_xp_003616958(seqidno:33)、mt_lyk10_xp_003613165(seqidno:39)、medtr5g042440.1(seqidno:41))、亚洲栽培稻(oryzasativa)(os;xp_015611967_oscerk1(seqidno:36)、oscebip(seqidno:43))和百脉根(lotusjaponicus)(lj;bai79273.1_cerk6(seqidno:30)、cae02590.1_nfr1(seqidno:32)、bai79284.1_epr3(seqidno:38)、cae02597.1_nfr5(seqidno:40))。nfr1和nfr5是nod因子受体,epr3是胞外多糖受体,atlyp1和atlyp3是肽聚糖受体,atcerk1、oscerk1、oscebip、cerk6是壳寡糖受体。显示了三个lysm结构域的侧面的c(x)xxxc和cxc基序。显示了lysm1(黑线)、lysm2(灰线)和lysm3(灰线)。图8a显示包括全部lysm1结构域和部分lysm2结构域的比对的前两个部分。图8b显示包括剩余lysm2结构域和全部lysm3结构域的比对的第三和第四部分。图8c显示比对的第五部分。

图9a-9b显示从以下选择的lysm受体的比对:拟南芥(at;at3g21630_cerk1(seqidno:37))、玉米(zeamays)(zm;xp_020399958_zm1(seqidno:20)、xp_008652982.l_zm5(seqidno:21)、aqk73561.1_zm7(seqidno:46)、np_001147981.1_zm3(seqidno:47)、np_001147941.2_zm6(seqidno:48)、aqk58792.1_zm4(seqidno:49)、zm9_np_001146346.1(seqidno:34))、大麦(hordeumvulgare)(hv;horvu4hr1g066170_hvlysmrlk10(seqidno:19)、ak357612_hvlysmrlk2(seqidno:17)、ak370300_hvlysmrlk1(seqidno:16)、ak372128_hvlysmrlk3(seqidno:18)、hvlysmrlk4_ak369594.1(seqidno:35))、亚洲栽培稻(oryzasativa)(os;xp_015611967_oscerk1(seqidno:36))、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)(mt;xp_003613904.2_mtnfp(seqidno:45)、mt_lyk3_xp_003616958(seqidno:33)、mt_lyk9_xp_003601376(seqidno:31))和百脉根(lotusjaponicus)(lj;cae02590.1_nfr1(seqidno:32)、cae02597.1_nfr5(seqidno:40)、bai79273.1_cerk6(seqidno:30))。ljnfr1、ljnfr5、mtlyk3和mtnfp是功能nod因子受体,atcerk1、oscerk1、ljcerk6是功能几丁质受体。显示了三个lysm结构域的侧面的c(x)xxxc和cxc基序。显示了lysm1(黑线)、lysm2(灰线)和lysm3(灰线)。位于lysm1之前的c(x)xxxc基序中“x”残基的数量在受体之间变化,因此在该图中和在连续的图中的比对中,lysm1的位置(黑线)相应地变化。图9a显示包括全部lysm1结构域和部分lysm2结构域的比对的第一和第二部分。图9b显示包括剩余lysm2结构域和全部lysm3结构域的比对的第三和第四部分。

图10a-10b显示从以下选择的lysm受体的比对:玉米(zeamays)(zm;onm41523.1_zm8(seqidno:50)、xp_008657477.1_zm2(seqidno:51)、zm00001d043516zm10(seqidno:53))、大麦(hordeumvulgare)(hv;mloc_5489.2_hvlysm-rlk9(seqidno:52)、mloc_18610.1_hvlysm-rlk8(seqidno:54)、mloc_57536.1_hvlysm-rlk6(seqidno:55))、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)(mt;mt_lyk10_xp_003613165(seqidno:39)、mt_lyk3_xp_003616958(seqidno:33)、xp_003613904.2_mtnfp(seqidno:45))和百脉根(lotusjaponicus)(lj;bai79284.1_epr3(seqidno:38),cae02590.1_nfr1(seqidno:32),cae02597.1_nfr5(seqidno:40))。ljnfr1、ljnfr5、mtlyk3和mtnfp是功能nod因子受体,ljepr3是功能eps受体。显示了三个lysm结构域的侧面的c(x)xxxc和cxc基序。显示了lysm1(黑线)、lysm2(灰线)和lysm3(灰线)。图10a显示包括全部lysm1结构域和全部lysm2结构域的比对的第一、第二和第三部分。图10b显示包括全部lysm3结构域的比对的第四、第五和第六部分。

图11a-11b显示从以下选择的lysm受体的比对:拟南芥(at;at1g21880.2_lyp2(seqidno:56)、at1g77630_lyp3(seqidno:42)、at2g17120_lyp1(seqidno:44))、亚洲栽培稻(oryzasativa)(os;oscebip(seqidno:43))和百脉根(lotusjaponicus)(lj;ljlyp1(seqidno:57)、ljlyp2(seqidno:58)、ljlyp3(seqidno:58)、cae02590.1_nfr1(seqidno:32)、cae02597.1_nfr5(seqidno:40))。ljnfr1、ljnfr5是功能nod因子受体,atlyp2和atlyp3是pgn受体,oscebip是功能几丁质受体。显示了三个lysm结构域的侧面的c(x)xxxc和cxc基序。显示了lysm1(黑线),lysm2(灰线)和lysm3(灰线)。图11a显示包括全部lysm1结构域、全部lysm2结构域和全部lysm3结构域的比对的第一、第二、第三和第四部分。图11b显示比对的第五、第六和第七部分。

图12a-12e显示先前已知的lco受体和新鉴定的lco受体的注释的氨基酸序列。图12a显示了注释关键;用下划虚线显示lysm1结构域,用下划实线显示lysm2结构域,以粗体显示疏水补丁残基和用斜体的残基显示lysm3结构域。显示了苜蓿属nfp(mtnfp/1-595;seqidno:1)、莲属nfr5(已知的lco受体;ljnfr5/1-595;seqidno:2)、豌豆sym10(已知的lco受体;豌豆_sym10/1-594;seqidno:3)和大豆nfr5α(已知的lco受体;gmnfr5α/1-598max;seqidno:4)。图12b显示了鹰嘴豆nfr5(新的lco受体;鹰嘴豆nfr5/1-557(鹰嘴豆(cicerarietinum));seqidno:5)、菜豆nfr5(新的lco受体;beannfr5/1-597(菜豆(phaseolusvulgaris));seqidno:7)、花生nfr5(新的lco受体;peanutnfr5/1-595[花生亚种花生(arachishypogaeasubsp.hypogaea)];seqidno:9)和莲属lys11(新的lco受体;ljlys11/1-591;seqidno:11)。图12c显示了苜蓿属lyr1(新的lco受体;mtlyr1/1-590;seqidno:12)、拟山黄麻属nfp1(新的lco受体;pannfp1/1-613;seqidno:13)、拟山黄麻属nfp2(已知的lco受体;pannfp2/1-582;seqidno:14)和大麦受体hvlysm-rlk1(新的lco受体;hvlysm-rlk1(ak370300);seqidno:16)。图12d显示了大麦受体hvlysm-rlk2(新的lco受体;hvlysm-rlk2(ak357612);seqidno:17)、大麦受体hvlysm-rlk3ak372128(新的lco受体;hvlysm-rlk3ak372128;seqidno:18)、大麦受体hvlysm-rlk10(新的lco受体;hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170);seqidno:19)和玉蜀黍受体zm1(新的lco受体;zm1(xp_020399958);seqidno:20)。图12e显示了玉蜀黍受体zm5(新的lco受体;zm5(xp_008652982.1);seqidno:21)、苹果nfp5(新的lco受体;xp_008338966.1predicted:丝氨酸/苏氨酸受体样激酶nfp[苹果(malusdomestica)];seqidno:22)和草莓nfr5(新的lco受体;xp_004300586.2predicted:蛋白质lyk5样[野草莓亚种草莓(fragariavescasubsp.vesca)];seqidno:23)。

图13a-13d显示了大麦rlk10受体(hvrlk10)胞外域的同源性建模和使用hvrlk10胞外域的结合实验的结果。图13a在顶部显示了纯化的hvrlk10胞外域的示意图(n-末端=n’;lysm1=m1;lysm2=m2;lysm3=m3;用于纯化的6x组氨酸标签=6xhis;c-末端=c’)和在底部显示了具有co5的hvrlk10胞外域的结合测定的结果。图13b显示了大麦受体rlk10(hvrlk10)胞外域的同源性建模,具有根据其静电电势遮蔽住的表面描绘。由黑色虚线圈出疏水补丁,且疏水补丁的顶部处显示了co配体。图13c显示了具有百脉根中慢生根瘤菌lco的hvrlk10胞外域的结合测定的结果。图13d显示了具有苜蓿中华根瘤菌lco的hvrlk10胞外域的结合测定的结果。对于图13a和13c-13d,y-轴上显示了以nm的结合、x-轴上显示了以秒(s)的时间和图的标题中显示了测试的分子(co5,百脉根中慢生根瘤菌lco和苜蓿中华根瘤菌lco)。

图14a-14c显示了去糖基化的nfp-ecd和糖基化的nfp-ecd的saxs分析和用于去糖基化的nfp-ecd和糖基化的nfp-ecd的无量纲的kratky图。图14a显示了saxs分析,示出对于去糖基化的nfp-ecd的具有模型拟合的散射曲线(c2;左图),纪尼厄图(guinierplot)(顶部中间图),和具有指示的dmax的p(r)距离分布图(底部中间图),以及对于去糖基化的nfp-ecd,对接入saxs包膜的nfp-ecd晶体结构(显示了延伸茎样结构;整体尺寸以埃显示)。图14b显示了saxs分析,示出对于糖基化的nfp-ecd的具有模型拟合的散射曲线(c2;左图),纪尼厄图(顶部中间图),和具有指示的dmax的p(r)距离分布图(底部中间图),以及对于糖基化的nfp-ecd,对接入saxs包膜的nfp-ecd晶体结构(显示延伸茎样结构;整体尺寸以埃显示)。图14c显示了对于去糖基化的nfp-ecd(grey)和糖基化的nfp-ecd(浅灰色)的无量纲的kratky图(基于rg、guinier和基于vc)。

图15a-15e显示了nfp-ecd结合至苜蓿中华根瘤菌lco-v、百脉根中慢生根瘤菌lco-v和几丁质(壳五糖;co5)的bli结合曲线。图15a显示了nfp-ecd以22.3±0.1μm的平均kd结合苜蓿中华根瘤菌lco-v(通过每个点的平均值的整体拟合r2描述的拟合优度=0.99;n=7)。图15b显示了nfp-ecd以因为结合太弱而不能拟合的kd(n=6)结合百脉根中慢生根瘤菌lco-v。图15c显示了nfp-ecd不结合几丁质(n=6)。图15d显示了nfp-ecd结合至苜蓿中华根瘤菌lco-iv和lco-iv变体的bli结合曲线结果表。图15e显示了nfp-ecd结合至苜蓿中华根瘤菌lco-iv和lco-iv变体的bli结合曲线结果。对于图15a-15c和15e,将七个2倍稀释系列的分析物(1.56–100μm)用于每个实验;以实线代表实验结合曲线,以虚线代表拟合曲线;和指示使用独立蛋白质制备物进行的重复数量。对于图15d-15e,图3a中显示的lco-iv变体且拟合优度通过每个点的平均值的整体拟合r2描述。

图16a-16d显示了wtnfp-ecd和疏水补丁突变体nfp-ecd(l147d/l154d)结合至苜蓿中华根瘤菌lco-iv的bli结合曲线和nfp受体的示意图。图16a显示了wtnfp-ecd结合至苜蓿中华根瘤菌lco-iv。图16b显示了l147d/l154dnfp-ecd结合至苜蓿中华根瘤菌lco-iv。对于图16a-16b,将七个2倍稀释系列的分析物(1.56–100μm)用于每个实验;和以实线代表实验结合曲线,以虚线代表拟合曲线。图16c显示了总结图16a-16b的动力学参数的表,具有拟合优度通过每个点的平均值的整体拟合r2进行描述,和指示了使用独立蛋白质制备物进行的重复数量。图16d显示了具有lysm1、lysm2、lysm3、茎和跨膜(tm)和标记的激酶结构域的nfp受体的示意图,并且用灰色的柱指示lysm2中疏水补丁的位置。示意图以下的数字提供了相应的氨基酸残基,并且显示了lysm结构域侧面的cxc基序的位置。

图17a-17b显示了关于拟南芥cerk1(atcerk1)结合至壳五糖(co5)和壳八糖(co8)的bli结合曲线。图17a显示了atcerk1结合至壳五糖(几丁质(co5))。图17b显示了atcerk1结合至壳八糖(几丁质(co8))。关于图17a-17b示出了将七个2倍稀释系列的分析物(1.56–100μm)用于每个实验;以实线代表实验结合曲线,以虚线代表拟合曲线;拟合优度通过每个点的平均值的整体拟合r2进行描述;指示使用独立蛋白质制备物进行的重复数量;并且显示动力学参数(kon和koff)。

具体实施方式

以下描述陈述示例性方法、参数等。然而,应该认识到这种描述不旨在作为本公开的范围的限制,而是作为示例性实施方式的描述提供的。

基因改变的植物和种子

本公开的某些方面涉及含有编码异源受体多肽的核酸序列的基因改变的植物或植物部分,其中异源受体多肽选自下述的组中:与seqidno:5(即鹰嘴豆,鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第一多肽,与seqidno:7(即菜豆,菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第二多肽,与seqidno:9(即花生,花生属(arachis)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第三多肽,与seqidno:11(即莲属(lotus)lys11)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第四多肽,与seqidno:12(即苜蓿属lyr1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第五多肽,与seqidno:13(即拟山黄麻属nfp1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第六多肽,与seqidno:16(即大麦hvlysm-rlk1(ak370300))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第七多肽,与seqidno:17(即大麦hvlysm-rlk2(ak357612))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第八多肽,与seqidno:18(即大麦hvlysm-rlk3ak372128)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第九多肽,与seqidno:19(即大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十多肽,与seqidno:20(即玉蜀黍zm1(xp_020399958))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十一多肽,与seqidno:21(即玉蜀黍zm5(xp_008652982.1))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十二多肽,与seqidno:22(即苹果nfp5xp_008338966.1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十三多肽或与seqidno:23(即草莓nfr5xp_004300586.2)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十四多肽。在一些实施方式中,异源受体多肽选自下述的组中:seqidno:5(即鹰嘴豆,鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5)、seqidno:7(即菜豆,菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5)、seqidno:9(即花生,花生属(arachis)nfr5)、seqidno:11(即莲属(lotus)lys11)、seqidno:12(即苜蓿属(medicago)lyr1)、seqidno:13(即拟山黄麻属(parasponia)nfp1)、seqidno:16(即大麦hvlysm-rlk1(ak370300))、seqidno:17(即大麦hvlysm-rlk2(ak357612))、seqidno:18(即大麦hvlysm-rlk3ak372128)、seqidno:19(即大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170))、seqidno:20(即玉蜀黍zm1(xp_020399958))、seqidno:21(即玉蜀黍zm5(xp_008652982.1))、seqidno:22(即苹果nfp5xp_008338966.1)和seqidno:23(即草莓nfr5xp_004300586.2)。在一些实施方式中,异源受体多肽的表达允许植物或其部分通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。在一些实施方式中,lco由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中,lco由选自下述的组中的固氮菌产生:百脉根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)、华癸中慢生根瘤菌(mesorhizobiumhuakuii)、地中海中慢生根瘤菌(mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(rhizobiumetliphaseoli)、贾氏根瘤菌(rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(r.leguminosarumtrifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumviciae)和菜豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、药用中华根瘤菌(sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)ngr234、茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobiumcaulinodans)、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobiumelkanii)、辽参慢生根瘤菌(bradyrhizobiumliaonginense)、根瘤菌属(rhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、中华根瘤菌属(sinorhizobium)物种、固氮根瘤菌属(azorhizobium)物种、弗兰克氏菌属(frankia)物种或其任何组合,或由选自下述的组中的菌根真菌产生:无柄孢子科(acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(gigasporaceae)物种、平囊霉科(pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(funneliformis)物种、球囊霉属(glomus)物种、球囊霉属(rhizophagus)物种、硬囊霉属(sclerocystis)物种、septoglomus属物种、claroideoglomus属物种、ambispora属物种、原囊霉属(archaeospora)物种、geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(paraglomus)属物种、球囊霉门(glomeromycota)中的其他物种或其任何组合。在一些实施方式中,异源多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中,植物细胞是根细胞。在一些实施方式中,根细胞是根表皮细胞或根皮质细胞。在一些实施方式中,异源多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,植物选自下述的组中:玉米(例如,玉蜀黍、玉米(zeamays)),水稻(例如,亚洲栽培稻(oryzasativa)、非洲栽培稻(oryzaglaberrima)、菰属(zizania)物种,大麦(例如,大麦(hordeumvulgare),小麦(例如,普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(triticumaestivum)、斯卑尔脱小麦(triticumspelta)、硬粒小麦(triticumdurum)、小麦属(triticum)物种),山黄麻属(trema)物种(例如,光叶山黄麻(tremacannabina)、tremacubense、tremadiscolor、tremadomingensis、tremaintegerrima、tremalamarckiana、小花山黄麻(tremamicrantha)、异色山黄麻(tremaorientalis)、tremaphilippinensis、tremastrigilosa、山黄麻(trematomentosa)),苹果(例如,西洋苹果(maluspumila),梨(例如,西洋梨(pyruscommunis)、白梨(pyrus×bretschneideri)、沙梨(pyruspyrifolia)、新疆梨(pyrussinkiangensis)、川梨(pyruspashia)、梨属(pyrus)物种),李子(例如,西梅、西洋李子,布拉斯李、欧洲李(prunusdomestica)、中国李(prunussalicina)),杏子(例如,山杏(prunusarmeniaca)、布里扬松杏(prunusbrigantina)、东北杏(prunusmandshurica)、梅(prunusmume)、西伯利亚杏(prunussibirica)),桃子(例如,油桃、桃(prunuspersica),扁桃(例如,甜扁桃(prunusdulcis)、扁桃(prunusamygdalus)),胡桃(例如,波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(juglansregia)、黑胡桃(juglansnigra)、白胡桃(juglanscinerea)、加州胡桃(juglanscalifornica)),草莓(例如,草莓(fragaria×ananassa)、智利草莓(fragariachiloensis)、弗州草莓(fragariavirginiana)、野草莓(fragariavesca)),树莓(例如,欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(rubusidaeus)、美国黑树莓(rubusoccidentalis)、硬毛树莓(rubusstrigosus)),黑莓(例如,常青黑莓,喜马拉雅黑莓、黑莓(rubusfruticosus)、北美黑莓(rubusursinus)、裂叶黑莓(rubuslaciniatus)、尖齿黑莓(rubusargutus)、亚美尼亚黑莓(rubusarmeniacus)、露莓(rubusplicatus)、榆叶黑莓(rubusulmifolius)、美国黑莓(rubusallegheniensis)),红醋栗(例如,红丛茶蔍子(ribesrubrum)、红茶藨子(ribesspicatum)、高山茶藨子(ribesbesalpinum)、ribesschlechtendalii、多花茶藨子(ribesmultiflorum)、岩生茶藨子(ribespetraeum)、伏生茶藨子(ribestriste)),黑醋栗(例如,黑茶藨子(ribesnigrum),甜瓜(例如,西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(citrulluslanatus)、冬瓜(benincasahispida)、罗马甜瓜(cucumismelocantalupensis)、冬甜瓜(cucumismeloinodorus)、网纹甜瓜(cucumismeloreticulatus)),黄瓜(例如,切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(cucumissativus)),南瓜(例如,美国南瓜(cucurbitapepo)、笋瓜(cucurbitamaxima)),倭瓜(例如,葫芦、西葫芦(cucurbitaargyrosperma)、黑子南瓜(cucurbitaficifolia)、笋瓜(cucurbitamaxima)、中国南瓜(cucurbitamoschata)),葡萄(例如,葡萄(vitisvinifera)、山葡萄(vitisamurensis)、美洲葡萄(vitislabrusca)、白亮葡萄(vitismustangensis)、河岸葡萄(vitisriparia)、圆叶葡萄(vitisrotundifolia))或大麻(例如,印度大麻、大麻(cannabissativa))。

在任何以上实施方式的一些实施方式中:植物部分是叶、茎、根、根原基、花、种子、果实、核、谷粒、细胞或其部分。在一些实施方式中,部分是果实、核或谷粒。

在一些方面中,本公开涉及任何以上实施方式的基因改变的植物的花粉粒或胚珠。

在一些方面中,本公开涉及从任何以上实施方式的植物产生的原生质体。

在一些方面中,本公开涉及从来自任何以上实施方式的植物的原生质体或细胞产生的组织培养物,其中细胞或原生质体从选自由下述组成的组中的植物部分产生:叶、花药、雌蕊、茎、叶柄、根、根原基、根尖、果实、种子、花、子叶、下胚轴、胚胎和分生组织细胞。

在一些方面中,本公开涉及含有编码异源受体多肽的核酸序列的基因改变的植物种子,其中异源受体多肽选自下述的组中:与seqidno:5(即鹰嘴豆,鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第一多肽,与seqidno:7(即菜豆,菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第二多肽,与seqidno:9(即花生,花生属(arachis)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第三多肽,与seqidno:11(即莲属(lotus)lys11)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第四多肽,与seqidno:12(即苜蓿属(medicago)lyr1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第五多肽,与seqidno:13(即拟山黄麻属(parasponia)nfp1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第六多肽,与seqidno:16(即大麦hvlysm-rlk1(ak370300))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第七多肽,与seqidno:17(即大麦hvlysm-rlk2(ak357612))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第八多肽,与seqidno:18(即大麦hvlysm-rlk3ak372128)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第九多肽,与seqidno:19(即大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十多肽,与seqidno:20(即玉蜀黍zm1(xp_020399958))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十一多肽,与seqidno:21(即玉蜀黍zm5(xp_008652982.1))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十二多肽,与seqidno:22(即苹果nfp5xp_008338966.1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十三多肽或与seqidno:23(即草莓nfr5xp_004300586.2)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十四多肽。在一些实施方式中,异源受体多肽选自下述的组中:seqidno:5(即鹰嘴豆,鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5),seqidno:7(即菜豆,菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5),seqidno:9(即花生,花生属(arachis)nfr5),seqidno:11(即莲属(lotus)lys11),seqidno:12(即苜蓿属(medicago)lyr1),seqidno:13(即拟山黄麻属(parasponia)nfp1),seqidno:16(即大麦hvlysm-rlk1(ak370300)),seqidno:17(即大麦hvlysm-rlk2(ak357612)),seqidno:18(即大麦hvlysm-rlk3ak372128),seqidno:19(即大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170)),seqidno:20(即玉蜀黍zm1(xp_020399958)),seqidno:21(即玉蜀黍zm5(xp_008652982.1)),seqidno:22(即苹果nfp5xp_008338966.1),和seqidno:23(即草莓nfr5xp_004300586.2)。在一些实施方式中,异源受体多肽的表达允许植物或其部分通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。在一些实施方式中,lco由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中,lco由选自下述的组中的固氮菌产生:百脉根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)、华癸中慢生根瘤菌(mesorhizobiumhuakuii)、地中海中慢生根瘤菌(mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(rhizobiumetliphaseoli)、贾氏根瘤菌(rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(r.leguminosarumtrifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumviciae)和菜豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、药用中华根瘤菌(sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)ngr234、茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobiumcaulinodans)、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobiumelkanii)、辽参慢生根瘤菌(bradyrhizobiumliaonginense)、根瘤菌属(rhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、中华根瘤菌属(sinorhizobium)物种、固氮根瘤菌属(azorhizobium)物种、弗兰克氏菌属(frankia)物种或其任何组合,或由选自下述的组中的菌根真菌产生:无柄孢子科(acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(gigasporaceae)物种、平囊霉科(pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(funneliformis)物种、球囊霉属(glomus)物种、球囊霉属(rhizophagus)物种、硬囊霉属(sclerocystis)物种、septoglomus属物种、claroideoglomus属物种、ambispora属物种、原囊霉属(archaeospora)物种、geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(paraglomus)属物种、球囊霉门(glomeromycota)中的其他物种或其任何组合。在一些实施方式中,当种子生长为植物时,异源多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中,植物细胞是根细胞。在一些实施方式中,根细胞是根表皮细胞或根皮质细胞。在一些实施方式中,当种子生长为植物时,异源多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,植物选自下述的组中:玉米(例如,玉蜀黍、玉米(zeamays)),水稻(例如,亚洲栽培稻(oryzasativa)、非洲栽培稻(oryzaglaberrima)、菰属(zizania)物种,大麦(例如,大麦(hordeumvulgare),小麦(例如,普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(triticumaestivum)、斯卑尔脱小麦(triticumspelta)、硬粒小麦(triticumdurum)、小麦属(triticum)物种),山黄麻属(trema)物种(例如,光叶山黄麻(tremacannabina)、tremacubense、tremadiscolor、tremadomingensis、tremaintegerrima、tremalamarckiana、小花山黄麻(tremamicrantha)、异色山黄麻(tremaorientalis)、tremaphilippinensis、tremastrigilosa、山黄麻(trematomentosa)),苹果(例如,西洋苹果(maluspumila),梨(例如,西洋梨(pyruscommunis)、白梨(pyrus×bretschneideri)、沙梨(pyruspyrifolia)、新疆梨(pyrussinkiangensis)、川梨(pyruspashia)、梨属(pyrus)物种),李子(例如,西梅、西洋李子,布拉斯李、欧洲李(prunusdomestica)、中国李(prunussalicina)),杏子(例如,山杏(prunusarmeniaca)、布里扬松杏(prunusbrigantina)、东北杏(prunusmandshurica)、梅(prunusmume)、西伯利亚杏(prunussibirica)),桃子(例如,油桃、桃(prunuspersica),扁桃(例如,甜扁桃(prunusdulcis)、扁桃(prunusamygdalus)),胡桃(例如,波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(juglansregia)、黑胡桃(juglansnigra)、白胡桃(juglanscinerea)、加州胡桃(juglanscalifornica)),草莓(例如,草莓(fragaria×ananassa)、智利草莓(fragariachiloensis)、弗州草莓(fragariavirginiana)、野草莓(fragariavesca)),树莓(例如,欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(rubusidaeus)、美国黑树莓(rubusoccidentalis)、硬毛树莓(rubusstrigosus)),黑莓(例如,常青黑莓,喜马拉雅黑莓、黑莓(rubusfruticosus)、北美黑莓(rubusursinus)、裂叶黑莓(rubuslaciniatus)、尖齿黑莓(rubusargutus)、亚美尼亚黑莓(rubusarmeniacus)、露莓(rubusplicatus)、榆叶黑莓(rubusulmifolius)、美国黑莓(rubusallegheniensis)),红醋栗(例如,红丛茶蔍子(ribesrubrum)、红茶藨子(ribesspicatum)、高山茶藨子(ribesbesalpinum)、ribesschlechtendalii、多花茶藨子(ribesmultiflorum)、岩生茶藨子(ribespetraeum)、伏生茶藨子(ribestriste)),黑醋栗(例如,黑茶藨子(ribesnigrum),甜瓜(例如,西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(citrulluslanatus)、冬瓜(benincasahispida)、罗马甜瓜(cucumismelocantalupensis)、冬甜瓜(cucumismeloinodorus)、网纹甜瓜(cucumismeloreticulatus)),黄瓜(例如,切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(cucumissativus)),南瓜(例如,美国南瓜(cucurbitapepo)、笋瓜(cucurbitamaxima)),倭瓜(例如,葫芦、西葫芦(cucurbitaargyrosperma)、黑子南瓜(cucurbitaficifolia)、笋瓜(cucurbitamaxima)、中国南瓜(cucurbitamoschata)),葡萄(例如,葡萄(vitisvinifera)、山葡萄(vitisamurensis)、美洲葡萄(vitislabrusca)、白亮葡萄(vitismustangensis)、河岸葡萄(vitisriparia)、圆叶葡萄(vitisrotundifolia))或大麻(例如,印度大麻、大麻(cannabissativa))。

在一些方面中,本公开涉及从以上实施方式的任何一项的基因改变的植物种子产生的植物,其中植物表达异源多肽,并且其中异源多肽的表达允许植物通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。

在一些方面中,本公开涉及能够识别含有至少一种经修饰的核酸序列的lco的植物或其部分,所述经修饰的核酸序列含有植物或其部分中高亲和性和/或高选择性lco受体的至少一种编码序列,其中lco受体在植物或其部分中表达;其中lco受体的表达允许植物来识别lco。在一些实施方式中,本公开涉及能够识别含有至少一种经修饰的核酸序列具有高亲和性和/或高选择性的lco的植物或其部分,所述修饰核酸序列含有植物或其部分中高亲和性和/或高选择性lco受体的至少一种编码序列,其中高亲和性和/或高选择性lco受体在植物或其部分中表达;其中高亲和性和/或高选择性lco受体的表达允许植物来识别具有高亲和性和/或高选择性的lco。在一些实施方式中,lco受体来自豆类。

lysm受体是熟知的和很好理解的受体类型。lysm受体具有位于蛋白质的胞外域的三个特征结构域:lysm1、lysm2和lysm3,其在蛋白质序列上以该顺序存在。lysm1结构域朝向蛋白质序列的n-末端定位,并且先于n-末端信号肽以及c(x)xxxc基序。lysm1结构域通过cxc基序与lysm2结构域分开并且lysm2结构域也通过cxc基序与lysm3结构域分开。三个lysm基序以及c(x)xxxc和cxc基序在图8a-8c中清楚地显示。图9a-9b、图10a-10b和图11a-11b显示nod因子(例如,lco)lysm受体、epslysm受体和几丁质(co)以及pgnlysm受体的个别比对,再次清楚地描绘了三个lysm基序以及c(x)xxxc和cxc基序。因此,lysm受体的分类对本领域技术人员是已知的。

如本公开中使用的,术语“选择性”指不同多糖配体之间,具体地作为类别的脂壳寡糖(lco)和其他多糖配体,优选地壳寡糖(co)之间的差异。本公开的lysm受体在其lysm2结构域中含有疏水补丁。该疏水补丁赋予超过co的lco的选择性识别,并且因此与不具有疏水补丁的lysm受体相比,具有疏水补丁的lysm受体具有高选择性。

如本公开中使用的,术语“亲和性”通常指对lco的亲和性。此外,本公开的lysm受体的lysm2结构域中存在的疏水补丁赋予对lco的更高亲和性。因此,与不具有疏水补丁的lysm受体相比,具有疏水补丁的lysm受体具有高亲和性。亲和性可使用以下示例中描述的方法,以及使用本领域已知的测量结合动力学、缔合、解离和kd的其他方法测量。由于至少这些原因,本领域技术人员将容易理解本公开的高亲和性和高选择性lysm受体。

产生和培养基因改变的植物的方法

本公开的某些方面涉及产生任何以上实施方式的基因改变的植物的方法,其包括将基因改变引入包括核酸序列的植物。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,核酸序列被插入植物的基因组,以便核酸序列可操作地连接至内源启动子。在一些实施方式中,内源启动子是根特异性启动子。

本公开的某些方面涉及产生能够识别lco的基因改变的植物的方法,其包括步骤:将基因改变引入植物,包括提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco得到识别的能力,从而使植物能够识别lco。

在一些方面中,本公开涉及产生能够识别lco的基因改变的植物的方法,其包括步骤:将基因改变引入植物,包括提供具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco得到识别的能力,从而使植物能够识别具有高亲和性和/或高选择性的lco。

在一些方面中,本公开涉及培养具有识别lco的能力的植物的方法,其包括步骤:提供具有一个或多个基因改变的种子,所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco得到识别的的能力,其中种子产生具有识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力的植物;在一定条件下培养植物,其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比,识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中,植物在营养贫瘠的土壤中栽培。

在一些方面中,本公开涉及培养具有识别具有高亲和性和/或高选择性的lco的能力的植物的方法,其包括步骤:提供具有一个或多个基因改变的种子,所述基因改变提供具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco得到识别的的能力,其中种子产生具有识别具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力的植物;在一定条件下培养植物,其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物相比,识别具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中,植物在营养贫瘠的土壤中栽培。

在一些方面中,本公开涉及培养具有识别lco的能力的植物的方法,其包括步骤:提供具有一个或多个基因改变的组织培养物或原生质体,所述基因改变提供由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco得到识别的的能力;使组织培养物或原生质体再生为小植株;使小植株生长为植物,其中植物具有识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力;移植植物至一定的条件,其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比,识别由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中,植物在营养贫瘠的土壤中栽培。

在一些方面中,本公开涉及培养具有识别具有高亲和性和/或高选择性的lco的能力的植物的方法,其包括步骤:提供具有一个或多个基因改变的组织培养物或原生质体,所述基因改变提供具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco得到识别的的能力,使组织培养物或原生质体再生为小植株;使小植株生长为植物,其中植物具有识别具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力;移植植物至一定的条件,其中与在相同条件下生长的缺少一个或多个基因改变的植物生长相比,识别具有高亲和性和/或高选择性的由固氮菌和/或菌根真菌产生的lco的能力导致生长、产率和/或生物质增加。在一些实施方式中,植物在营养贫瘠的土壤中栽培。

在任何以上方法的一些实施方式中,识别lco的能力由编码异源受体多肽的核酸序列赋予,其中异源受体多肽选自下述的组中:与seqidno:5(即鹰嘴豆,鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第一多肽,与seqidno:7(即菜豆,菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第二多肽,与seqidno:9(即花生,花生属(arachis)nfr5)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第三多肽,与seqidno:11(即莲属(lotus)lys11)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第四多肽,与seqidno:12(即苜蓿属(medicago)lyr1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第五多肽,与seqidno:13(即拟山黄麻属(parasponia)nfp1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第六多肽,与seqidno:16(即大麦hvlysm-rlk1(ak370300))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第七多肽,与seqidno:17(即大麦hvlysm-rlk2(ak357612))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第八多肽,与seqidno:18(即大麦hvlysm-rlk3ak372128)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第九多肽,与seqidno:19(即大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十多肽,与seqidno:20(即玉蜀黍zm1(xp_020399958))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十一多肽,与seqidno:21(即玉蜀黍zm5(xp_008652982.1))具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十二多肽,与seqidno:22(即苹果nfp5xp_008338966.1)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十三多肽或与seqidno:23(即草莓nfr5xp_004300586.2)具有至少70%序列同一性,至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%序列同一性的第十四多肽。在一些实施方式中,异源受体多肽选自下述的组中:seqidno:5(即鹰嘴豆,鹰嘴豆(cicerarietinum)nfr5)、seqidno:7(即菜豆,菜豆(phaseolusvulgaris)nfr5)、seqidno:9(即花生,花生属(arachis)nfr5)、seqidno:11(即莲属(lotus)lys11)、seqidno:12(即苜蓿属(medicago)lyr1)、seqidno:13(即拟山黄麻属(parasponia)nfp1)、seqidno:16(即大麦hvlysm-rlk1(ak370300))、seqidno:17(即大麦hvlysm-rlk2(ak357612))、seqidno:18(即大麦hvlysm-rlk3ak372128)、seqidno:19(即大麦hvlysm-rlk10(horvu4hr1g066170))、seqidno:20(即玉蜀黍zm1(xp_020399958))、seqidno:21(即玉蜀黍zm5(xp_008652982.1))、seqidno:22(即苹果nfp5xp_008338966.1)和seqidno:23(即草莓nfr5xp_004300586.2)。在一些实施方式中,异源受体多肽的表达允许植物或其部分通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。在一些实施方式中,lco由固氮菌或由菌根真菌产生。在一些实施方式中,lco由选自下述的组中的固氮菌产生:百脉根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)、华癸中慢生根瘤菌(mesorhizobiumhuakuii)、地中海中慢生根瘤菌(mesorhizobiummediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(mesorhizobiumciceri)、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、蒙古根瘤菌(rhizobiummongolense)、热带根瘤菌(rhizobiumtropici)、菜豆埃特里根瘤菌(rhizobiumetliphaseoli)、贾氏根瘤菌(rhizobiumgiardinii)、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)任选地三叶草豌豆根瘤菌(r.leguminosarumtrifolii)、蚕豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumviciae)和菜豆豌豆根瘤菌(r.leguminosarumphaseoli)、伯克氏菌目(burkholderiales)任选地含羞草的共生体、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)、药用中华根瘤菌(sinorhizobiummedicae)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)、费氏中华根瘤菌(sinorhizobiumfredii)ngr234、茎瘤固氮根瘤菌(azorhizobiumcaulinodans)、大豆慢生根瘤菌(bradyrhizobiumjaponicum)、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobiumelkanii)、辽参慢生根瘤菌(bradyrhizobiumliaonginense)、根瘤菌属(rhizobium)物种、中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)物种、中华根瘤菌属(sinorhizobium)物种、固氮根瘤菌属(azorhizobium)物种、弗兰克氏菌属(frankia)物种或其任何组合,或由选自下述的组中的菌根真菌产生:无柄孢子科(acaulosporaceae)物种、多孢囊霉科(diversisporaceae)物种、巨孢囊霉科(gigasporaceae)物种、平囊霉科(pacisporaceae)物种、管柄囊霉属(funneliformis)物种、球囊霉属(glomus)物种、球囊霉属(rhizophagus)物种、硬囊霉属(sclerocystis)物种、septoglomus属物种、claroideoglomus属物种、ambispora属物种、原囊霉属(archaeospora)物种、geosiphonpyriformis属物种、类球囊霉属(paraglomus)属物种、球囊霉门(glomeromycota)中的其他物种或其任何组合产生。在一些实施方式中,异源多肽位于植物细胞质膜。在一些实施方式中,植物细胞是根细胞。在一些实施方式中,根细胞是根表皮细胞或根皮质细胞。在一些实施方式中,异源多肽在发育中的植物根系中表达。在一些实施方式中,核酸序列可操作地连接至启动子。在一些实施方式中,启动子是根特异性启动子。在一些实施方式中,启动子选自下述的组中:nfr1或nfr5/nfp启动子、莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子、几丁质酶启动子、玉蜀黍zrp2启动子、番茄leextl启动子、谷氨酰胺合酶大豆根启动子、rcc3启动子、水稻antiquitine启动子、lrr受体激酶启动子或拟南芥pco2启动子。在一些实施方式中,启动子是任选地选自下述的组中的组成型启动子:camv35s启动子、camv35s启动子的衍生物、玉蜀黍泛素启动子、三叶启动子、静脉花叶木薯病毒启动子或拟南芥ubq10启动子。在一些实施方式中,植物选自下述的组中:玉米(例如,玉蜀黍、玉米(zeamays)),水稻(例如,亚洲栽培稻(oryzasativa)、非洲栽培稻(oryzaglaberrima)、菰属(zizania)物种,大麦(例如,大麦(hordeumvulgare),小麦(例如,普通小麦、斯卑尔脱小麦、硬粒小麦、普通小麦(triticumaestivum)、斯卑尔脱小麦(triticumspelta)、硬粒小麦(triticumdurum)、小麦属(triticum)物种),山黄麻属(trema)物种(例如,光叶山黄麻(tremacannabina)、tremacubense、tremadiscolor、tremadomingensis、tremaintegerrima、tremalamarckiana、小花山黄麻(tremamicrantha)、异色山黄麻(tremaorientalis)、tremaphilippinensis、tremastrigilosa、山黄麻(trematomentosa)),苹果(例如,西洋苹果(maluspumila),梨(例如,西洋梨(pyruscommunis)、白梨(pyrus×bretschneideri)、沙梨(pyruspyrifolia)、新疆梨(pyrussinkiangensis)、川梨(pyruspashia)、梨属(pyrus)物种),李子(例如,西梅、西洋李子,布拉斯李、欧洲李(prunusdomestica)、中国李(prunussalicina)),杏子(例如,山杏(prunusarmeniaca)、布里扬松杏(prunusbrigantina)、东北杏(prunusmandshurica)、梅(prunusmume)、西伯利亚杏(prunussibirica)),桃子(例如,油桃、桃(prunuspersica),扁桃(例如,甜扁桃(prunusdulcis)、扁桃(prunusamygdalus)),胡桃(例如,波斯胡桃、英国胡桃、黑胡桃、胡桃(juglansregia)、黑胡桃(juglansnigra)、白胡桃(juglanscinerea)、加州胡桃(juglanscalifornica)),草莓(例如,草莓(fragaria×ananassa)、智利草莓(fragariachiloensis)、弗州草莓(fragariavirginiana)、野草莓(fragariavesca)),树莓(例如,欧洲红树莓、黑树莓、覆盆子(rubusidaeus)、美国黑树莓(rubusoccidentalis)、硬毛树莓(rubusstrigosus)),黑莓(例如,常青黑莓,喜马拉雅黑莓、黑莓(rubusfruticosus)、北美黑莓(rubusursinus)、裂叶黑莓(rubuslaciniatus)、尖齿黑莓(rubusargutus)、亚美尼亚黑莓(rubusarmeniacus)、露莓(rubusplicatus)、榆叶黑莓(rubusulmifolius)、美国黑莓(rubusallegheniensis)),红醋栗(例如,红丛茶蔍子(ribesrubrum)、红茶藨子(ribesspicatum)、高山茶藨子(ribesbesalpinum)、ribesschlechtendalii、多花茶藨子(ribesmultiflorum)、岩生茶藨子(ribespetraeum)、伏生茶藨子(ribestriste)),黑醋栗(例如,黑茶藨子(ribesnigrum),甜瓜(例如,西瓜、冬瓜、卡萨巴甜瓜、哈密瓜、白兰瓜、香瓜、西瓜(citrulluslanatus)、冬瓜(benincasahispida)、罗马甜瓜(cucumismelocantalupensis)、冬甜瓜(cucumismeloinodorus)、网纹甜瓜(cucumismeloreticulatus)),黄瓜(例如,切黄瓜、腌制黄瓜、英国黄瓜、黄瓜(cucumissativus)),南瓜(例如,美国南瓜(cucurbitapepo)、笋瓜(cucurbitamaxima)),倭瓜(例如,葫芦、西葫芦(cucurbitaargyrosperma)、黑子南瓜(cucurbitaficifolia)、笋瓜(cucurbitamaxima)、中国南瓜(cucurbitamoschata)),葡萄(例如,葡萄(vitisvinifera)、山葡萄(vitisamurensis)、美洲葡萄(vitislabrusca)、白亮葡萄(vitismustangensis)、河岸葡萄(vitisriparia)、圆叶葡萄(vitisrotundifolia))或大麻(例如,印度大麻、大麻(cannabissativa))。

分子生物方法以产生基因改变的植物和植物细胞

本发明的一个实施方式提供了包括一个或多个修饰的植物基因和/或引入的基因的基因改变的植物或植物细胞。例如,本公开提供了具有编码异源受体多肽的核酸序列的基因改变的植物。异源受体允许植物通过异源受体多肽识别脂壳寡糖(lco)。

基因改变的单子叶植物和双子叶植物植物细胞的转化和生成是本领域熟知的。参见,例如,weising等,ann.rev.genet.22:421-477(1988);美国专利5,679,558;agrobacteriumprotocols,ed:gartland,humanapressinc.(1995)和wang等actahort.461:401-408(1998)。方法的选择随着待转化的植物的类型、特别的应用和/或所需结果而变化。熟练的技术人员很容易选择适当的转化技术。

本领域已知的删除、插入或以其他的任何方法修饰细胞dna(例如,基因组dna和细胞器dna)可用于实践本文公开的发明。作为示例,crispr/cas-9和相关系统可用于将异源基因插入基因组dna中的靶向位点或基本上编辑内源基因以表达异源基因。例如,含有用于根癌农杆菌中靶基因的删除或插入的遗传构建体的非致瘤ti质粒可用于转化植物细胞,并且其后,转化植物可使用本领域中,例如,ep0116718、ep0270822、pct公布wo84/02913和公布的欧洲专利申请(“ep”)0242246中描述的方法从转化的植物细胞中再生。ti-质粒载体各自含有ti-质粒的t-dna的边界序列之间或至少位于右侧边界序列的左侧的基因。当然,其他类型的载体可用于转化植物细胞,使用如下过程比如直接基因转移(如例如ep0233247中描述的)、花粉介导的转化(如例如ep0270356、pct公布wo85/01856和us专利4,684,611中描述的)、植物rna病毒介导的转化(如例如ep0067553和us专利4,407,956中描述的)、脂质体介导的转化(如例如us专利4,536,475中描述的)和其他方法比如用于转化玉米(例如,us专利6,140,553;fromm等,bio/technology(1990)8,833839);gordon-kamm等,theplantcell,(1990)2,603618)和水稻(shimamoto等,nature,(1989)338,274276;datta等,bio/technology,(1990)8,736740)的某些系的方法和一般用于转化单子叶植物的方法(pct公布wo92/09696)。对于棉花转化,可使用pct专利公开wo00/71733中描述的方法。对于大豆转化,参考本领域已知的方法制造,例如,hinchee等(bio/technology,(1988)6,915)和christou等(trendsbiotech,(1990)8,145)或wo00/42207的方法。

本发明的基因改变的植物可用于常规的植物培育方案以产生更多具有相同特征的基因改变的植物或将基因改变引入其他品种的相同或相关植物物种中。从改变的植物获得的种子优选地含有基因改变作为在染色体或细胞器dna中的稳定插入片段或者作为对内源基因或启动子的修饰。按照本发明的包括基因改变的植物包括包含或源自包含本发明的基因改变的植物,例如果树或观赏植物的根状茎的植物。因此,本发明中包括插入转化植物或植物部分的任何非转基因嫁接植物部分。

无论是否在表达载体或表达盒中,引入的基因元件导致引入的基因的表达通常将利用植物可表达的启动子。如本文使用的“植物可表达的启动子”指确保植物细胞中本发明的基因改变的表达的启动子。引导植物中组成型表达的启动子的示例是本领域已知的并且其包括:黄瓜花叶病毒(camv),例如,分离株cm1841(gardner等,nucleicacidsres,(1981)9,28712887)、cabbbs(franck等,cell(1980)21,285294)和cabbbji(hull和howell,virology,(1987)86,482493)的强组成型35s启动子(“35s启动子”);泛素家族的启动子(例如,christensen等,plantmolbiol,(1992)18,675-689的玉蜀黍泛素启动子),gos2启动子(depater等,theplantj(1992)2,834-844),emu启动子(last等,theorapplgenet,(1990)81,581-588),肌动蛋白启动子比如通过an等(theplantj,(1996)10,107)描述的启动子,通过zhang等(theplantcell,(1991)3,1155-1165)描述的水稻肌动蛋白启动子;木薯静脉花叶病毒的启动子(wo97/48819,verdaguer等(plantmolbiol,(1998)37,1055-1067),来自地下三叶草矮化病毒的启动子的pplex系列(wo96/06932,特别地s4或s7启动子),醇脱氢酶启动子,例如,padh1s(genbankaccessionnumbersx04049,x00581)以及分别驱动tdna的1和2基因的表达的tr1启动子和tr2启动子(分别为“tr1启动子”和“tr2启动子”)(velten等,emboj,(1984)3,27232730)。

可选地,植物可表达的启动子可以是组织特异性启动子,例如,引导植物的一些细胞或组织中,例如,根表皮细胞中的更高水平的表达启动子。通常在植物细胞中使用的组成型启动子的示例是花椰菜花叶(camv)35s启动子(kay等science,236,4805,1987)和该启动子的各种衍生物,玉蜀黍泛素启动子(christensen&quail,transgenicres,5,213-8,1996),三叶启动子(ljubql,maekawa等molplantmicrobeinteract.21,375-82,2008),静脉花叶木薯病毒启动子(国际申请wo97/48819)和拟南芥ubq10启动子(norris等,plantmol.biol.21,895-906,1993)。

在优选的实施方式中,将使用根特异性启动子。非限制性示例包括nfr1或nfr5/nfp启动子,特别地莲属nfr5启动子(seqidno:24)和莲属nfr1启动子(seqidno:25)、玉蜀黍甲硫氨酸启动子(deframond等,febs290,103-106,1991申请ep452269)、几丁质酶启动子(samac等,plantphysiol93,907-914,1990)、玉蜀黍zrp2启动子(美国专利号5,633,363)、番茄leextl启动子(bucher等,plantphysiol.128,911-923,2002)、谷氨酰胺合酶大豆根启动子(hirel等,plantmol.biol.20,207-218,1992)、rcc3启动子(pct申请wo2009/016104)、水稻antiquitine启动子(pct申请wo2007/076115)、lrr受体激酶启动子(pct申请wo02/46439)和拟南芥pco2启动子(heidstra等,genesdev.18,1964-1969,2004)。这些植物启动子可与增强子元件组合,它们可与最小的启动子元件组合,或可包括重复元件以确保所需表达特征。

在一些实施方式中,可利用在植物细胞中增加表达的基因元件。例如,引入的基因的5’端或3’端处或者在编码引入的基因的序列中的内含子,例如,hsp70内含子。其他这种基因元件可包括但不限于启动子增强子元件、两次重复或三次重复的启动子区域、与另一转基因不同或与内源(植物宿主)基因前导序列不同的5’前导序列、与相同植物中使用的另一转基因不同或与内源(植物宿主)尾随序列不同的3’尾随序列。

本发明的引入的基因可被插入宿主细胞dna,以便插入的基因部分是合适的3端转录调节信号(例如,转录体形成和多腺苷酸化信号)的上游(即5)。这优选地通过将基因插入植物细胞基因组(细胞核或叶绿体)中完成。优选的多腺苷酸化和转录体形成信号包括胭脂氨酸合酶基因(depicker等,j.molecapplgen,(1982)1,561-573)、章鱼碱合酶基因(gielen等,emboj,(1984)3:835845)、scsv或苹果酸酶末端(schunmann等,plantfunctbiol,(2003)30:453-460)和tdna基因7(velten和schell,nucleicacidsres,(1985)13,69816998)的那些,其在转化的植物细胞中充当3非翻译dna序列。在一些实施方式中,将一个或多个引入的基因稳定地整合入细胞核基因组。当核酸序列保持整合入细胞核基因组且通过随后植物世代继续被表达(例如,产生可检测的mrna转录体或蛋白质),存在稳定的整合。可通过任何本领域已知的方法(例如,微粒轰击、农杆菌属介导的转化、crispr/cas9、原生质体的电穿孔、微注射等)完成稳定整合入细胞核基因组和/或编辑细胞核基因组。

术语重组体或修饰的核酸指通过两个其他分开的序列区段的组合制造的多核苷酸,这是通过基因工程化技术或通过化学合成的由人工操作分离的多核苷酸的区段完成的。这样做可将所需功能的多核苷酸片段连接以产生所需功能的组合。

如本文使用的,术语“过度表达”和“上调”指作为基因修饰的结果相对于野生型生物体(例如,植物)中的表达增加的表达(例如,mrna、多肽等)。在一些实施方式中,表达的增加比野生型中的表达略微增加约10%。在一些实施方式中,表达的增加相对于野生型中的表达增加50%或更多(例如,60%、70%、80%、100%等)。在一些实施方式中,内源基因是过度表达的。在一些实施方式中,外源基因由于被表达而过度表达。植物中基因的过度表达可通过任何本领域已知的方法实现,其包括但不限于成型启动子、诱导型启动子、高表达启动子(例如,psad启动子)、增强子、转录和/或翻译调节序列、密码子优化、修饰的转录因子和/或控制待过度表达的基因的表达的经突变或经修饰基因的使用。

在重组核酸旨在用于特定序列的表达、克隆或复制时,用于引入宿主细胞而制备的dna构建体通常将包括由宿主识别的复制系统(例如载体),包括编码所需多肽的预期的dna片段,并且还可包括可操作地连接至编码多肽的区段的转录和翻译启动调节序列。可选地,这种构建体可包括细胞定位信号(例如,质膜定位信号)。在优选的实施方式中,这种dna构建体被引入宿主细胞的基因组dna、叶绿体dna或线粒体dna。

在一些实施方式中,非整合的表达系统可用于诱导一个或多个引入的基因的表达。表达系统(表达载体)可包括,例如,复制或自主复制序列(ars)的起点和表达控制序列、启动子、增强子和必要的加工信息位点,比如核糖体-结合位点、rna剪接位点、多腺苷酸化位点、转录终止子序列和mrna稳定化序列。也可适当的包括来自相同或相关物种的分泌多肽的信号肽,其允许蛋白质跨过和/或嵌入细胞膜、细胞壁,或从细胞中分泌。

用于实践本文公开的发明的方法的可选择标志物可以是正向可选择标志物。典型地,正向选择指在仅在细胞内存在目标重组体多核苷酸时,基因改变的细胞可在有毒的物质存在下存活的情况。负向可选择标志物和可筛选标志物在本领域也是熟知的且是本发明考虑的。本领域技术人员将认识到,任何可获得的相关标志物可在实践本文公开的发明中利用。

本发明的重组菌的筛选和分子分析可利用核酸杂交技术进行。杂交方法用于鉴定多核苷酸,比如使用本文描述的技术修饰的那些,其与本文教导使用的主题调节序列具有足够的同源性。特别的杂交技术对本发明不是必需的。随着杂交技术中进行的改善,它们可由本领域技术人员容易地应用。杂交探针可用本领域技术人员已知的任何适当的标记进行标记。可改变杂交条件和冲洗条件,例如温度和盐浓度,以改变检测阈值的严谨性。参见,例如,sambrook等(1989)参见下文或ausubel等(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,ny,n.y.,用于杂交条件的进一步引导。

可选地,基因改变的株系的筛选和分子分析以及所需分离的核酸的产生可使用聚合酶链式反应(pcr)进行。pcr是核酸序列的重复、酶促、引发合成。该方法对该领域的那些技术人员是熟知的和常用的(参见mullis,美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159;saiki等(1985)science230:1350-1354)。pcr基于目标dna片段的酶促扩增,目标dna片段的侧面是与靶序列的相对链杂交的两个寡核苷酸引物。引物以指向彼此的3’端定向。模板的热变性、引物退火至它们互补的序列以及用dna聚合酶延伸退火的引物的重复循环导致对由pcr引物的5’端限定的区段的扩增。因为每个引物的延伸产物可用作其他引物的模板,每个循环实质上使前一个循环中产生的dna模板的量加倍。这导致特定靶片段的指数积聚,在几小时内达到几百万倍。通过使用热稳定dna聚合酶比如taq聚合酶,其分离自嗜热性细菌水生栖热菌(thermusaquaticus),可完全自动化扩增过程。可使用的其他酶对本领域技术人员是已知的。

本发明的核酸和蛋白质也可涵盖具体地公开序列的同系物。同源性(例如,序列同一性)可以是50%-100%。在一些情况下,这种同源性大于80%、大于85%、大于90%或大于95%。序列的任何预期用途需要的同源性或同一性的程度容易由本领域技术人员鉴定。如本文使用的两个核酸的序列同一性百分比使用本领域已知的算法,比如由karlin和altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268公开的,karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5877中修饰的算法确定。这种算法被并入altschul等(1990)j.mol.biol.215:402-410的nblast和xblast程序中。blast核苷酸搜索用nblast程序进行,评分=100,字长=12,以获得具有所需序列同一性百分比的核苷酸序列。为了获得用于比较的目的的间隙比对,如altschul等(1997)nucl.acids.res.25:3389-3402中描述的使用间隙blast。当利用blast和间隙blast程序时,使用各自方法(nblast和xblast)的缺省参数。参见www.ncbi.nih.gov。

优选的宿主细胞是植物细胞。在本上下文中,重组体宿主细胞是那些已经基因修饰以含有分离的核酸分子,含有在宿主细胞中通常存在和有功能的一个或多个删除的或其他非功能基因,或含有产生至少一种重组体蛋白质的一个或多个基因。本发明的编码蛋白质的核酸可通过任何本领域已知的对特定类型的细胞适当的方法引入,所述方法包括但不限于转化、脂质转染、电穿孔或本领域技术人员已知的任何其他方法。

已经一般地描述了本发明,本发明将通过参考某些具体的实施例更好的理解,所述具体的实施例包括在本文中以进一步示例说明本发明并且不旨在限制由权利要求限定的本发明的范围。

实施例

在以下实施例中进一步详细描述本公,这些实施例不旨在以任何方式限制所要求保护的本公开的范围。附图意在被认为是本公开的说明书和描述的组成部分。提供以下实施例以举例说明,但不限制要求保护的公开内容。

实施例1:苜蓿属nfp胞外域的表达和纯化

以下实施例描述了用于制备所有以下实施例的蛋白质的蛋白质表达和纯化材料和方法。

材料和方法

苜蓿属nfp胞外域的表达和纯化:蒺藜苜蓿nfp胞外域(残基28-246)经密码子优化用于昆虫细胞表达(genscript,piscataway,usa)并且克隆至poet4杆状病毒转移载体(oxfordexpressiontechnologies)中。天然nfp信号肽(残基1-27,通过signalp4.1预测的)用acmnpvgp67信号肽代替以促进分泌并且将六组氨酸标签添加至c-末端。使用定点诱变工程化nfp的点突变体。用lipofectin(thermofisherscientific)作为转染试剂根据制造商的引导,使用flashbacgold试剂盒(oxfordexpressiontechnologies)在sf9细胞(草地夜蛾(spodopterafrugiperda))中产生重组杆状病毒。蛋白质表达如下进行。在补充有1%pen-strep(10000u/ml,lifetechnologies)和1%cd脂质浓缩物(gibco)的无血清max-xp(bd-biosciences,停产)或hyclonesfx(gehealthcare)培养基中,以299k摇动维持悬浮培养的sf9细胞。一旦sf9细胞达到1.0*10^6个细胞/ml的细胞密度,通过添加重组体3代病毒诱导蛋白质表达。在表达的5-7天后,通过离心收获含有nfp胞外域的培养基上清液。随后是在277k,针对50mmtris-hclph8,200mmnacl的过夜透析步骤。通过ni-imac纯化的两个随后步骤(histrapexcel/histraphp,都是gehealthcare)来富集nfp胞外域。对于晶体学实验,使用内切糖苷酶pngasef(1:15(w/w),室温,过夜)去除n-聚糖。作为最后的纯化步骤,在补充至总计500mmnacl(对于结合测定)或50mmtris-hcl,200mmnacl(对于晶体学),在ph7.2的磷酸盐缓冲盐水中,在superdex20010/300或hiloadsuperdex20016/600(都是gehealthcare)上通过sec纯化nfp胞外域。nfp胞外域作为对应于单体的单一均质峰洗脱。nfp点突变的版本根据相同方案进行表达和纯化。

实施例2:苜蓿属nfp胞外域的结构表征

以下实施例描述了苜蓿属nfp蛋白质胞外域的结构表征。

材料和方法

结晶和结构测定:在0.2m醋酸钠、0.1m二甲胂酸钠ph6.5和30%(w/v)peg-8000中,以3-5mg/ml使用蒸汽扩散设定获得去糖基化的nfp胞外域的晶体(参见实施例1)。在液氮中速冻之前,通过补充5%(w/v)peg-400在其结晶条件中对晶体进行冷冻保护。在maxlabi911-3光束线处获得至分辨率的完整的衍射数据。基于atcerk1胞外域结构(pdb坐标为4ebz)作为搜索模型,使用来自具有同源性建模的phenix套件的phaser通过分子替换解决相问题。分别使用coot和phenix套件进行模型构建和完善。生成了输出pdb填充的结构模型并且使用pdb2pqr和apbswebservers(pmid:21425296)计算其静电表面电势。使用apbs工具2.1在pymol中显示结果(delano,w.l.(2002).pymol.delanoscientific,sancarlos,ca,700.)。

小角度x-射线散射(saxs):在磷酸缓冲盐水,ph7.4,500mmnacl中,在emblp12光束线petraiii,在20℃控制温度的隔室中,在的波长,以不同浓度(对于糖基化的nfp-ecd是1、2、4和6mg/ml;和对于去糖基化的nfp-ecd是1、2和3mg/ml和1,2,4)分批测量nfp-ecd的小角度x-射线散射。使用bioxtasraw、gnom和atsas程序套件进行数据分析和建模(hopkins,j.b.,gillilan,r.e.&skou,s.bioxtasraw:improvementstoafreeopen-sourceprogramforsmall-anglex-rayscatteringdatareductionandanalysis.journalofappliedcrystallography50,1545–1553(2017);svergun,d.i.determinationoftheregularizationparameterinindirect-transformmethodsusingperceptualcriteria.journalofappliedcrystallography25,495–503(1992);konarev,p.v.,volkov,v.v.,sokolova,a.v.,koch,m.h.j.&svergun,d.i.primus:awindowspc-basedsystemforsmall-anglescatteringdataanalysis.journalofappliedcrystallography36,1277–1282(2003))。使用15个单独的重建在dammif中对从头开始的低分辨率结构进行建模。用damaver对包膜进行对齐且平均(franke,d.&svergun,d.i.dammif,aprogramforrapidab-initioshapedeterminationinsmall-anglescattering.journalofappliedcrystallography42,342–346(2009))。在dammin中最终改善了平均值(svergun,d.i.restoringlowresolutionstructureofbiologicalmacromoleculesfromsolutionscatteringusingsimulatedannealing.biophysicaljournal76,2879–2886(1999))。具有添加n-和c-末端尾部的nfp-ecd模型以刚体融入包封具有颜色(wriggers,w.&chacón,p.usingsitusfortheregistrationofproteinstructureswithlowresolutionbeadmodelsfromx-raysolutionscattering.journalofappliedcrystallography91434,773–776(2001))。在crysol在线中计算理论散射曲线(svergun,d.,barberato,c.&koch,m.h.j.crysol–aprogramtoevaluatex-raysolutionscatteringofbiologicalmacromoleculesfromatomiccoordinates.journalofappliedcrystallography28,768–773(1995))。在bioxtasraw中制备无量纲的kratky图(hopkins,j.b.,gillilan,r.e.&skou,s.bioxtasraw:improvementstoafreeopen-sourceprogramforsmall-anglex-rayscatteringdatareductionandanalysis.journalofappliedcrystallography50,1545–1553(2017))。使用内部bsa标准确定源自正向散射的分子量。用oligomer分析混合物(konarev,p.v.,volkov,v.v.,sokolova,a.v.,koch,m.h.j.&svergun,d.i.primus:awindowspc-basedsystemforsmall-anglescatteringdataanalysis.journalofappliedcrystallography36,1277–1282(2003))。

结果

使用基于atcerk1的内部低b因子支架的同源性模型通过分子替换确定苜蓿属nfp-ecd的结构。以这种方式构建nfp-ecd的完整结构(残基33-233),包括在电子密度图中清楚分辨的四个n-糖基化。nfp形成致密结构,其中三种经典的βααβlysm结构域紧密地相互连接且通过3个保守的二硫桥(c3-c104、c47-c166和c102-c164)得到稳定(图1a)。二硫化物连接方式和整个支架排列与几丁质防御信号传导中涉及的其他lysm-rlk蛋白质共享,支撑这些类型的受体的共同进化起源(zhang2007)。

为了确认确定的结构,在nfp-ecd上进行小角度x-射线散射(saxs)测量。图1b显示了saxs重建的包膜,其与确定的结构具有相同整体尺寸,并且另外良好适合于晶体结构。另外,在saxs重建的包膜中看到了很可能源自受体的c-末端茎区域的细长脊状结构。在lcolysm受体同系物当中,该茎区域在长度上和一定程度地在序列上是保守的,提示这些受体中的胞外域与膜需要某些距离,用于正确功能。

还进行saxs测量以比较去糖基化的和糖基化的nfp-ecd。图14a显示了去糖基化的nfp-ecd的saxs分析,而图14b显示了糖基化的nfp-ecd的saxs分析。saxs数据和重建的从头开始模型与晶体结构一致,然而另外存在细长茎样结构(图1b)。该茎区域很可能由nfp的c-末端部分组成,nfp的c-末端部分在晶体结构不可见,并且可能用于从质膜的正确距离处的nfp的胞外域的位置。图14c比较去糖基化的和糖基化的nfp-ecd的无量纲的kratky图,并且该比较显示了聚糖对nfp-ecd的球状性具有影响。糖基化的nfp-ecd具有更球形的形状,其中峰值接近guinier-kratky点(虚线,图14c的左图)且更接近理想的球的表面/体积比(0.82,虚线,图14c的右图)。该更球状的形状可能由于15-20kda的聚糖的存在。在聚糖去除后,球状性和细长形状的损失变得更明显和可见(图14c的两个图中的去糖基化的nfp-ecd)。

实施例3:不同壳寡糖(co)、脂壳寡糖(lco)和碳水化合物配体的nfp结合能力和亲和性

以下实施例描述了测量nfp结合能力和亲和性的实验。设计这些实验以研究nfp是否对不同配体具有不同结合能力和亲和性。

材料和方法

微量热泳动(mst):荧光标记了nfp(proteinlabelingkitbluenhs,nanotempertechnologies)。恒定浓度的nfp用于测量与系列稀释的配体的结合。使用的配体是co4几丁质低聚物(对应于苜蓿中华根瘤菌lco-iv的主链)、co5几丁质低聚物(对应于苜蓿中华根瘤菌lco-v的主链)、麦芽六糖(来自苜蓿中华根瘤菌的碳水化合物)和辛糖胞外多糖(eps)。使用s形的剂量响应模型在graphpadprism7App(graphpadsoftware,inc.)中进行数据分析以获得平衡解离常数值。

生物层干涉法(bli):在octetred96系统(pallfortebio)上测量nfp和突变版本的nfp与配体的结合。使用的配体是lco-iv(来自苜蓿中华根瘤菌)、lco-v(来自苜蓿中华根瘤菌)、lco-v(来自百脉根中慢生根瘤菌)和co6(来自百脉根中慢生根瘤菌)。苜蓿中华根瘤菌lco由四聚体/五聚体n-乙酰葡糖胺主链组成,所述四聚体/五聚体n-乙酰葡糖胺主链在还原末端残基上是o-硫酸化的,在非还原末端残基上是o-乙酰化的和由不饱和c16酰基进行单-n-酰化。百脉根中慢生根瘤菌lco是五聚体n-乙酰葡糖胺,具有在非还原末端残基处的顺式-异油酸和氨基甲酰基和在还原末端残基处的2,4-o-乙酰基岩藻糖。将生物素化的配体缀合物以125-250nm的浓度固定在链霉抗生物素生物传感器(kineticquality,pallfortebio)上5分钟。使用苜蓿中华根瘤菌配体(lco-iv和lco-v)的结合测定重复七次,而使用百脉根中慢生根瘤菌配体(lco-v和co6)的结合测定重复六次。在graphpadprism6(graphpadsoftware,inc.)中进行数据分析。通过对针对蛋白质浓度绘制的平衡处的响应应用非线性回归(一个位点,特异性结合)确定源自稳态的平衡解离常数。通过对减去数据的非线性回归(在解离之后缔合)确定动力学参数。

结果

因为lco由n-乙酰葡糖胺(几丁质)主链组成,第一测试测量nfp是否对分别对应于苜蓿中华根瘤菌lco-iv和lco-v主链的co4和co5几丁质低聚物具有亲和性。在微量热泳动(mst)实验中,发现nfp分别以150μm和93μm的解离常数(kd)结合co4和co5。然而,nfp不能结合从苜蓿中华根瘤菌纯化的不相关碳水化合物配体麦芽六糖或寡糖胞外多糖。这显示nfp选择性结合几丁质的配体。

由于疏水粘性性质和胶束相,lco配体难以在溶液中处理,其阻碍了精确的浓度测定。为了克服该问题,使用了以前开发的化学方法来用生物素化的接头来位点特异性标记lco的还原端。使用生物层干涉法(bli),发现nfp以26±0.2μm的kd结合固定的苜蓿中华根瘤菌lco-iv和以32±0.2μm的kd结合苜蓿中华根瘤菌lco-v(图2a)。有趣地,没有检测到nfp结合百脉根中慢生根瘤菌lco-v,并且也没有检测到nfp结合百脉根中慢生根瘤菌co6(图2b)。

进一步bli测定显示nfp-ecd以22.3±0.1μm的平均kd结合苜蓿中华根瘤菌lco-v(图15a)。nfp-ecd微弱地结合百脉根中慢生根瘤菌lco-v(kd可不拟合;图15b),并且不结合几丁质(图15c)。如图15d-15e中显示,与野生型苜蓿中华根瘤菌lco-iv相比,在nodl-lco-iv中的非还原端上消除o-乙酰基基团将与nfp-ecd的结合减少了10倍以上(133.2±0.3μm的kd)。nodh-lco-iv中缺乏还原端硫酸盐将与nfp-ecd的结合明显减少了21倍以上(275.3±1.3μm的kd),其可说明在苜蓿属中用这种非硫酸化lco观察到的钙尖峰的减少(oldroyd,g.e.d.,mitra,r.m.,wais,r.j.&long,s.r.evidenceforstructurallyspecificnegativefeedbackinthenodfactorsignaltransductionpathway.theplantjournal28,191–284199(2001))。类似地,含有异油酸c18:1代替c16:2脂肪酸的nodfe-lco-iv和缺乏乙酰基和示出c20:1脂肪酸的nodfl-lco-iv二者显示没有显著的结合,反应出接种各个苜蓿中华根瘤菌突变体后没有能力诱导根瘤发育和感染线形成(ardourel,m.等,rhizobiummelilotilipooligosaccharidenodulationfactors:differentstructuralrequirementsforbacterialentryintotargetroothaircellsandinductionofplantsymbioticdevelopmentalresponses.plantcell6,1357–1374(1994))。数据支撑结论:fp直接识别其同源lco配体上存在的所有单个修饰,使nfp成为高特异性受体。

这些结果显示nfp具有不同结合能力和亲和性,取决于配体。而且,这些这些结果显示nfp在由不同共生体物种产生的相同配体之间可不同(比较来自苜蓿中华根瘤菌lco-v和百脉根中慢生根瘤菌lco-v的结果)。这指示nfp可基于直接lco结合来区分共生体。

实施例4:突变的脂壳寡糖(lco)配体的nfp结合能力和亲和性

使用细菌突变体并测量lco应用后根毛中钙瞬变的研究已经显示,末端n-乙酰葡糖胺残基上的侧链修饰在功能上很重要(oldroydge1,murrayjd,pooleps,anddownieja.annurevgenet.2011;45:119-44)。以下实施例描述了为了理解lco侧链装饰如何使用来自苜蓿中华根瘤菌的nfp和其同源lco配体而有助于这种显见的选择性进行的实验。

材料和方法

突变的脂壳寡糖(lco)配体:苜蓿中华根瘤菌lco由四聚体/五聚体n-乙酰葡糖胺主链组成,四聚体/五聚体n-乙酰葡糖胺主链在还原末端残基是o-硫酸化的,在非还原末端残基上是o-乙酰化的和由不饱和c16酰基进行单-n-酰化。本文使用的lco配体是从苜蓿中华根瘤菌nodh、nodl、nodfe和nodfl突变体纯化的。这些突变体的每一个在lco的末端部分上缺少一个或多个侧链修饰。图3a描绘了苜蓿中华根瘤菌lco-iv,并且指示在每种突变体中改变侧链修饰。

配体结合测试:如在实施例3中的进行配体结合测试。

结果

图3b显示了使用突变的lco的配体结合测试的结果。在用具有缺失硫酸修饰的nodh-lco的测试中和在用缺少o-乙酰基基团的nodl-lco的测试中看到结合至nfp的明显减少。这与用这些苜蓿中华根瘤菌突变体接种植物后观察到干扰结瘤和感染以及在应用这些突变的lco之后发现减少钙瞬变一致。类似地,使用含有异油酸c18:1代替c16:2脂肪酸的nodfe-lco的测试减少nfp结合。进一步,缺少o-乙酰基基团和含有异油酸c18:1的nodfl双突变体显示不结合nfp。这反映了在用各个苜蓿中华根瘤菌突变体的植物接种后观察到的干扰结瘤、不能诱导结节发育和缺少感染线形成(ardourelm,等,plantcell.1994oct;6(10):1357-74.)。合起来看,该数据显示,nfp受体可识别其同源lco配体的各个修饰。

实施例5:用于脂壳寡糖(lco)感知的重要残基的鉴定

以下实施例描述了使用结构引导方法以鉴定用于lco感知的nfp中的重要残基。在鉴定重要残基后,产生nfp点突变且使用以上描述的配体-结合测定进行测试(参见实施例3和实施例4)。

材料和方法

结构引导残基鉴定:nfp胞外域在结构上与配体-结合cerk1对齐。然后,将静电表面电势映射到nfp胞外域的先前-开发的结构。在图4a中描绘了预测的配体-结合位置和静电表面电势。

nfp点突变的产生:用天冬氨酸残基代替nfp亮氨酸残基l147和l154。天冬氨酸与亮氨酸尺寸是类似的,但带负电,而亮氨酸是疏水的。使用位点定向诱变工程化nfp的点突变体。特别地,双突变的nfp是工程化的,其中亮氨酸残基l147和l154用天冬氨酸残基代替以产生突变体nfpl147dl154d。如实施例中描述的表达和纯化nfp的点突变版本。

nfp突变体结合测定:使用nfp野生型(wt)蛋白质的结合测定重复七次,而使用nfp突变体nfpl147dl154d的结合测定重复四次。

生物层干涉法(bli):在octetred96系统(pallfortebio)上测量nfpwt和nfpl147d/l154d突变体与苜蓿中华根瘤lco-iv的结合。苜蓿中华根瘤lco由四聚体/五聚体n-乙酰葡糖胺主链组成,所述四聚体/五聚体n-乙酰葡糖胺主链在还原末端残基上是o-硫酸化的,在非还原末端残基上是o-乙酰化的和由不饱和c16酰基进行单-n-酰化。将生物素化的配体缀合物以125-250nm的浓度固定在链霉抗生物素生物传感器(kineticquality,pallfortebio)上5分钟。用于nfpwt的结合测定重复7次,且用于nfpl147d/l154d突变体的结合测定重复4次。在graphpadprism6(graphpadsoftware,inc.)中进行数据分析。通过对在针对蛋白质浓度绘制的平衡处的响应应用非线性回归(一个位点,特异性结合)来确定源自稳态的平衡解离常数。通过对减去数据的非线性回归(在解离之后缔合)来确定动力学参数。结果在图16a-16c中显示。以相同方式测量拟南芥cerk1(atcerk1)与壳五糖(co5)和壳八糖(co8)的结合。结果在图17a-17b中显示。

结果

图4a显示了对结合至具有预测的几丁质和lco脂肪酸链位置的配体的nfp胞外域的建模。nfp胞外域与配体结合的cerk1的结构比对将几丁质定位在nfp的lysm2结合槽中,没有任何明显的碰撞。显著地,静电表面电势揭示了位于对接的几丁质分子的非还原部分附近的nfp胞外域上的疏水补丁,其潜在地可容纳lco配体的脂肪酸链。两个亮氨酸残基(l147和l154)被鉴定为供给该补丁以疏水特征的残基。

为了测试这些两个残基对lco结合的贡献,将两个残基用大小相似但带负电的天冬氨酸残基替代以产生nfpl147dl154d。有趣地是,双突变的nfpl147dl154d胞外域以近似两倍更低的亲和力结合苜蓿中华根瘤菌lco-iv;48.0±1.0μm的kd(图4b)。仔细检查结合动力学揭示了,在双突变体中,缔合(kon)几乎不受影响,而解离(koff)更快约15倍。这些结果显示了nfp胞外域的疏水补丁稳定了lco结合状态,并且该稳定化最可能经脂肪酸链发生。将lco脂肪酸对接在该疏水补丁和几丁质主链在lysm2结合位点中(源自cerk1)会发生硫酸根和乙酰基侧面基团面对k141。

lco结合至疏水补丁突变体的生物化学分析揭示了与wtnfp-ecd相比,纯化的l147d/l154dnfp-ecd以13倍更低的亲和力(166.7±4.2μm的kd)结合苜蓿中华根瘤菌lco-iv(图16a-16c)。与wtnfp-ecd相比,双突变体中缔合速率(kon)是更快4.5倍且解离速率(koff)明显增加59倍,提示了疏水补丁对由酰基链介导的lco结合具有强的稳定效果。

测量atcerk1结合至几丁质片段的结合动力学作为比较。如在图17a-17b中显示,看到快速缔合和解离速率。这些动力学是突变体l147d/l154dnfp-ecd观察到的动力学的回归(图16b)。atcerk1对几丁质片段的结合动力学与nfp对lco的结合动力学明显地不同(图16a)。

同时,数据提供了证据:nfp中的疏水补丁(图16d中显示)是对lco感知和共生信号传导至关重要的保守结构特征。

实施例6:苜蓿属nfp突变体中的互补测试

为了确认在先前的实施例中描述的生物化学观察,接下来使用多毛根转化在苜蓿属nfp突变体中进行互补测试。

材料和方法

互补测定:如在bozsoki等(2017)(bozsokiz,chengj,fengf,gyselk,vintherm,andersenkr,oldroydg,blaisem,radutoius,stougaardj(2017)receptor-mediatedchitinperceptioninlegumerootsisfunctionallyseparablefromnodfactorperception.procnatlacadsci114:e8118–e8127)中描述一般地进行构建体组装、植物生长条件、多毛根转化、结瘤和ros试验。图5中提供了构建体的一般示意图。测试的转基因是实施例5中描述的突变的lysm受体。另外,lysm2(q119f、k141e和t150h)中或lysm3(t216f)中测试nfp置换变体替换疏水补丁外部的残基。

结果

图6a-6b显示了互补测试的结果。图6a中显示的结果是互补测试,其中用苜蓿中华根瘤菌菌株1021接种植物。当用野生型nfp基因转化苜蓿属nfp突变体时,看见互补,其定义为在用苜蓿中华根瘤菌菌株1021接种后49天平均每个植物5个结节。相反地,在用苜蓿中华根瘤菌菌株1021接种后,用含有双突变的nfpl147dl154d(表面残基,五个nfp其疏水特征在lysm2中)的构建体转化的根每个植物不发育任何结节。使用在lysm2(q119f、k141e和t150h)中或lysm3(t216f)中nfp置换变体替换疏水补丁外部的残基的相应实验不影响结瘤。

使用药用中华根瘤菌接种重复这些互补实验,其已经报告以更高效率结瘤苜蓿属。图6b中显示的结果是互补测试,其中用药用中华根瘤菌接种植物。药用中华根瘤菌结果确认含有双突变的nfpl147dl154d的构建体互补不良。合起来看,这些结果显示nfp中的疏水补丁对于lco识别和功能共生信号传导是需要的。

实施例7:疏水补丁的保护

以前,已经显示豌豆中的sym10、莲属中的nfr5和大豆中的nfr5a对lco感知是重要的(参见,例如,plantcellphysiol.2010feb;51(2):201-14和madsen,eb等,nature.2003oct9;425(6958):637-40.)。所以,同源性建模用于确定邻近于苜蓿属nfp中鉴定的lysm2的疏水补丁是否是这些蛋白质间的保守特征。另外,进行莲属lys11的同源性建模,并且获得莲属lys11的晶体结构以验证同源性建模结果。

材料和方法

建模:用swiss-model进行同源性建模(biasini2014)。苜蓿属nfp的晶体结构作用模板模型,在其上绘制了靶受体的氨基酸序列。生成了输出pdb填充的结构模型并且使用pdb2pqr和apbswebservers(pmid:21425296)计算其静电表面电势。使用apbs工具2.1在pymol中显示结果(delano,w.l.(2002).pymol.delanoscientific,sancarlos,ca,700.)。

晶体结构:在0.1m钠丙二酸盐ph6.0和12%peg3350中,以6.8mg/ml,使用蒸汽扩散设定获得lys11的晶体。获得完整衍射数据并且基于atcerk1胞外域结构(pdb坐标为4ebz)的同源性模型作为搜索模型,使用来自phenix套件的phaser通过分子替换解决相问题。分别使用coot和phenix套件进行模型构建和完善。生成了输出pdb填充的结构模型和使用thepdb2pqr和apbswebservers(pmid:21425296)计算其静电表面电势。使用apbs工具2.1在pymol中显示结果(delano,w.l.(2002).pymol.delanoscientific,sancarlos,ca,700.)。

结果

图7a显示了豌豆中的sym10、莲属中的nfr5和大豆中的nfr5α的同源性建模结果。同源性建模揭示了疏水补丁确实存在于这些受体的lysm2结构域的正下方的等同位置。

为了调查该方法的预测能力,还对源自鹰嘴豆、菜豆和花生的基因组的最接近的受体同源物进行建模(图7b)。以前没有功能表征任何这些受体同源物。发现lysm2中的疏水补丁在这里也保守,预测这些蛋白质是nfp/nfr5类型的lco受体。

进一步,在假激酶的苜蓿属nfp和莲属nfr5家族中测试了建模的诊断能力。图7c-7d显示苜蓿属lyr1和莲属lys11二者含有指示lco受体功能的疏水补丁,鉴于它们在am共生中假定作用,其是感兴趣的(参见,例如,rasmussen,sr等,scirep.2016jul20;6:29733andgomez,sk等,bmcplantbiol.2009jan22;9:10.)。图7e显示了三个lco受体:莲属nfr5、豌豆sym10和大豆nfr5a的预测模型。模型显示为表面且按照它们静电表面电势着色。用黑虚线标出预测的疏水补丁并且在lysm2配体结合槽中显示co4几丁质分子。图7f显示了比较缺乏疏水补丁的两个受体,苜蓿属lyr3和莲属lys12。

为了在实验上验证该预测,与nfp相比,莲属lys11具有疏水补丁,确定了莲属lys11的晶体结构。图7g显示了比较莲属lys11模型(左;也在图7c中)与莲属lys11的晶体结构(右)。从晶体结构的静电表面电势,明显的是lys11的确含有lysm2中的疏水补丁,类似于nfp的lysm2中的疏水补丁。在通过结晶学确定的lys11实际结构中,已经通过建模预测的疏水结构域的存在证实了基于nfp的建模用于鉴定以前未表征的lco受体同系物中的疏水补丁的能力。

合起来看,这些结果显示疏水补丁是在nfp/nfr5受体(例如,lco受体)上发现的保守的结构指纹。因此,疏水补丁可用于预测性鉴定其他豆科植物中nfp/nfr5受体的类别,这在以前是不可能的。

实施例8:nfp/nfr5类别的非豆类lco受体的建模

接下来,同源性建模用于确定邻近于苜蓿属nfp中鉴定的lysm2的疏水补丁是否存在于大麦lysm受体激酶。

材料和方法

建模:用swiss-model进行同源性建模(biasini,m.等,swiss-model:modellingproteintertiaryandquaternarystructureusingevolutionaryinformation.nucleicacidsres.42,w252–w258(2014))。苜蓿属nfp的晶体结构作用模板模型,在其上绘制了靶受体的氨基酸序列。生成了输出pdb填充的结构模型并且使用pdb2pqr和apbswebservers(pmid:21425296)计算其静电表面电势。使用apbs工具2.1在pymol中显示结果(delano,w.l.(2002).pymol.delanoscientific,sancarlos,ca,700.)。

大麦rlk10胞外域的表达和纯化:大麦rlk10(hvrlk10;hvlysm-rlk10)胞外域(残基25-231;seqidno:29)经密码子优化用于昆虫细胞表达(genscript,piscataway,usa)且克隆至poet4杆状病毒转移载体(oxfordexpressiontechnologies)中。天然rlk10信号肽用gp64信号肽代替以促进分泌并且将六组氨酸(6xhis)标签添加至c-末端,制作序列hvrlk10-ecto(25-231)、n-端gp64、c-端6his(seqidno:28)。用lepofectin(thermofisherscientific)作为转染试剂根据制造商的引导,使用flashbacgold试剂盒(oxfordexpressiontechnologies)在sf9细胞(草地夜蛾)中产生重组杆状病毒。蛋白质表达如下进行。在补充有1%pen-strep(10000u/ml,lifetechnologies)和1%cd脂质浓缩物(gibco)的无血清的max-xp(bd-biosciences,停产)或hyclonesfx(gehealthcare)培养基中,以299k摇动维持悬浮培养的sf9细胞。一旦sf9细胞达到1.0*10^6个细胞/ml的细胞密度,通过添加重组体3代病毒诱导蛋白质表达。在表达的5-7天后,通过离心收获含有rlk10胞外域的培养基上清液。随后是在277k,针对50mmtris-hclph8,200mmnacl的过夜透析步骤。通过ni-imac纯化的两个后续步骤富集rlk10胞外域(histrapexcel/histraphp,都是gehealthcare)。

配体结合测试:如实施例3中使用bli进行配体结合测试。

结果

使用苜蓿属nfp结构作为模板进行了所有十种大麦lysm受体样激酶(rlk)的同源性建模。在大麦lysmrlk中,hvrlk10是最接近苜蓿属nfp的受体,并且使用该方法建模最佳。图13b显示了hvrlk10的同源性建模结构,其揭示了疏水补丁确实存在于该受体的lysm2结构域的正下方的等同位置。该清楚的疏水补丁指示hvrlk10是nfp/nfr5类型的lco受体。

为了在实验上验证该预测,表达且纯化hvrlk10胞外域用于结合实验(图13a的顶部处显示胞外域示意图)。显示hvrlk10胞外域结合百脉根中慢生根瘤菌lco(图13c)和苜蓿中华根瘤菌lco(图13d)二者。相反地,hvrlk10胞外域不结合co5(图13a)。这些结合研究显示预测的hvrlk10具有结合lco,但不结合co的疏水补丁。

合起来看,这些结果显示疏水补丁是在nfp/nfr5受体(例如,lco受体)间发现的保守的结构指纹。该保守性从豆科植物家族延伸至非豆类植物,比如大麦。因此,疏水补丁可用于预测性鉴定非豆类植物中nfp/nfr5受体的类别,这在以前是不可能的。

序列表

<110>奥尔胡斯大学

<120>表达识别脂壳寡糖的异源受体的基因改变的植物

<130>79454-20003.40

<140>notyetassigned

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<213>蒺藜苜蓿

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<213>百脉根

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<213>豌豆

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<213>鹰嘴豆

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lysleuleuthrservalserglnpheileasplysprovalilephe

325330335

glythralagluilemetglualathrmetasnleuaspgluargcys

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alametalaaspalaalaalathrserseraspvalphealaphegly

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<212>prt

<213>玉米

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151015

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ileargalavalleuglualaglyasplysargglualalysleuarg

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<210>21

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<212>prt

<213>玉米

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aspthrtyrvalvaltyrargthrglnserproglytyrleuaspleu

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lysalasertyrgluasnleuthrglutyrhisleuileglnasnleu

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asnproglysergluprothrserleuglnileglyglngluvalthr

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prometleuileprovalargglnargproargleuproalaproleu

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leuphevalalaileleualaargargargtyrarglyslysproser

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lysglyglylysleuleuthrglyvalserglnpheileasplyspro

325330335

ileilephevalgluglugluilemetglualathrmetasnleuasp

340345350

gluargcyslysileglyserthrtyrtyrargalalysleuaspgly

355360365

gluvalphealavallysproalalysglyaspvalseralagluleu

370375380

lysmetmetglnmetvalasnhisalaasnleuilelysleualagly

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465470475480

ileleuleuthralaasppheargalalysileserglypheserleu

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alalysproalametvalaspalaalaalathrserseraspvalphe

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alapheglyleuleuleuleugluleuleuserglyargargalamet

515520525

glualaargileglysergluileglymetleutrparggluilearg

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glyvalleugluthrglyasplysargglualalysleuarglystrp

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metaspproalaleuglyserglutyrhismetaspvalalaleuser

565570575

leualasermetalaargalacysthrglugluaspalaalaargarg

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<210>22

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<212>prt

<213>苹果

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leuleuphephethralaargileleualaglnserthrproserasn

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valleuleuvalserserleuleualailephealavaltyrthrarg

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tyrleuglylysproilemettyrgluvallysthrilemetgluala

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340345350

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vallysleumetglyvalsersergluthraspglyserargpheleu

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valtyrglutyralaalaasnglyserleuasplystrpleutyrser

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420425430

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435440445

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450455460

ileleuleuaspserlysphelysalalysilealaasnphesermet

465470475480

alaargalaalaalaasnaspvalthrprolysvalaspvalpheala

485490495

pheglyvalvalleuleualaleuleuserglylyslysglymetglu

500505510

alalysgluasnglyglualailemetleutrplysaspvalargtrp

515520525

valleuglualaglugluglulysvalgluargleuarglystrpmet

530535540

aspproasnleugluasnphetyrproileaspglyalaleuserleu

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thralaleualaargalacysthrglnglulysproserthrargpro

565570575

sermetglygluvalvalpheasnleuservalleuthrhisserser

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serglnserthrleugluargsertrpthrseralaleuglualaglu

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<210>23

<211>624

<212>prt

<213>野草莓亚种草莓

<400>23

metalavalserpheleucyssersermetvalcysileleuleuleu

151015

phephephethrserglnileleualaglnproalaproglnserasn

202530

serthrthrserphesercysalavalaspalaprosersercysglu

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thrtyrvalalatyrphevalgluserproglytyrmetasnleuglu

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asnileseraspleupheglyvalservalserserileserglnala

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serasnleualasersertyrthrglyglnthrargleuvalalagly

859095

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100105110

phealaasnilethrtyrserilelysargglyaspsertyrtyrval

115120125

valsermettyrthrphegluasnleuthrargtrpproleuvalval

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glumetasnproalaleuvalproserleuleuglnileglyvallys

145150155160

valilepheproleuphecyslyscysproserlysmettyrserasp

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leuglyilelystyrleuleuthrtyrvaltrpglnthrasnaspasp

180185190

ilepheargvalseralalyspheasnileseralaleuasnileser

195200205

glyalaasnasnpheaspasnglyserprovalvalglyglnproval

210215220

leuileproleuthrlysleuproalaleuserglnproleupropro

225230235240

hisglylyshisilephelyshisargleumetleuilevalileile

245250255

cysleuglyvalalaleuservalalaserleuleualailepheleu

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valhisthrhisargleuarglysargglnlysleuleuasnasplys

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serleuserleugluseralaglutrppheargmetlysgluglylys

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glyvalsersertyrleuglylysalaileleutyraspvallysthr

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ilemetglualathrmetasnleuasnasphiscysglyileglygly

340345350

servaltyrargalavalileaspglylysvalleualavallyslys

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valargpheleuvaltyrglutyralagluasnglyserleuasplys

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argthrserasnileleuleuaspserlystyrlysalalysileala

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aspvalpheserpheglyvalileleuleuserleuleuserglylys

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lysglymetgluthrthraspasnglygluvalilemetleutrplys

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aspvalargglyvalleuglualagluglulyslysglnglulysleu

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<213>百脉根

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ttaatcatggagagaagcttatgtgcgtagcttctgtatttctgaattgattctatctgt660

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cccttaaaaatccggcaagacatcaagttagttggtcattagggttccaccagctagctg840

acaccttgtacaacaactggccgtcctaaagttgggtaagcattacaatactaaatgcca900

ttttattatattttgcgcatggttatatacctaagtaggatttgtccacagtttctttga960

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<211>1317

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tgtattcacttgattaagtgctagaaatcatctttgcatgatcatagattaaatgaattt120

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tcttgcaggtcatacaaattaaaatactagccaccacccaagacatactaaatggggtag300

tagagggaagggtaaggtcgataaggatgactttttattctataaaatttaggagaattt360

gagcttaagtggcaaggcaaacgacattactatacgaattggctttgtaccagaaacagg420

gaacaaataatattttacaaataagctattatcatgtcagctcatttgttcaactttgat480

ttgattaaaaattaaatgaagttgaatttgttgagctgctttattatatatgccactgga540

tgtttccgcattctaagtgcatgtttgaaaacatttctacaattgattacgaaggaaaaa600

ttaatcatggagagaagcttatgtgcgtagcttctgtatttctgaattgattctatctgt660

acagtagcatttagataatgaatgatcttggttctcgctaagcatcaaaccaatctctac720

ccttttaaaattgcaagaattataagtcatgcattgacccaaatccttctgtggttatgc780

cccttaaaaatccggcaagacatcaagttagttggtcattagggttccaccagctagctg840

acaccttgtacaacaactggccgtcctaaagttgggtaagcattacaatactaaatgcca900

ttttattatattttgcgcatggttatatacctaagtaggatttgtccacagtttctttga960

ttcggaaaggaaaaaatatttagttgacactgacagaagcagattttatatacatatatt1020

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gtacacacttatcaacttgctggaatataggaaagtctaaccaatgatgtcgatccgtat1140

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<211>61

<212>prt

<213>蒺藜苜蓿

<400>26

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151015

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202530

asntyrleugluphelysasnpheasnproasnleuserprothrleu

354045

leuproleuaspthrlysvalservalproleuphecys

505560

<210>27

<211>61

<212>prt

<213>百脉根

<400>27

cysalaglyasnhisserseralaasnthrsertyrglnileglnleu

151015

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202530

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354045

leuprogluargvallysvalvalpheproleuphecys

505560

<210>28

<211>233

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>28

metvalseralailevalleutyrvalleuleualaalaalaalahis

151015

seralaphealaglnglyglyalaglyasnglythrglyargpheala

202530

cysvalvalproalaprocysaspthrphevalleutyrargthrgln

354045

serproglyserleuaspleuglyalaileseraspleupheglyval

505560

serargalametilealaalaalaasnasnleuserleuileaspglu

65707580

aspalaalaleuleuproaspglnproleuleuvalprovalargcys

859095

glycysthrglyasnargserphevalasnvalthrtyrproilehis

100105110

serglyaspthrphetyralaleualaleuthrglytyrgluasnleu

115120125

thrthrproaspvalileglngluleuasnproglnalavalpheasn

130135140

lysleuasnvalserglnleuvalthrvalproleuphecysargcys

145150155160

prothrproalagluargseralaglyvalleuglnglnilethrtyr

165170175

mettrpargprovalaspthrmetserargvalserlysleumetgly

180185190

seraspalaseralailealaalaalaasnasnvalseralaaspphe

195200205

thrserthrthrmetleuprometleuileprovalalaargpropro

210215220

valleuprohishishishishishis

225230

<210>29

<211>207

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>29

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151015

alaprocysaspthrphevalleutyrargthrglnserproglyser

202530

leuaspleuglyalaileseraspleupheglyvalserargalamet

354045

ilealaalaalaasnasnleuserleuileaspgluaspalaalaleu

505560

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asnargserphevalasnvalthrtyrproilehisserglyaspthr

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valileglngluleuasnproglnalavalpheasnlysleuasnval

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130135140

gluargseralaglyvalleuglnglnilethrtyrmettrpargpro

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165170175

alailealaalaalaasnasnvalseralaaspphethrserthrthr

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metleuprometleuileprovalalaargproprovalleupro

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<210>30

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<212>prt

<213>百脉根

<400>30

metgluhisproargleuglypheproilethrleuleuleupheser

151015

pheileleuleuproserthrserglnserlyscysthrhisglycys

202530

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trpleuargargpheasnsertyrproproaspasnileproaspthr

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glythrleuasnvalthrvalasncyssercysglyaspserglyval

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ileproalalysaspglnasnglysertyrvalleuleuglyserser

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valasplysservalgluphesertyraspgluleualathralathr

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325330335

valtyrtyralagluleuargglygluargalaalailelyslysmet

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370375380

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valglnilealaleuaspseralaargglyleuglutyrilehisglu

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histhrvalprovaltyrilehisargaspilelysseralaasnile

435440445

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serprolysvalaspvaltyralapheglyvalvalleutyrgluleu

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prothrgluaspleuarglysleuvalaspglnargleuglyaspasn

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<210>31

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<212>prt

<213>蒺藜苜蓿

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serilepheleualaserilepropheilethrgluserlyscysthr

202530

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354045

asnleuthrtyrileserserilemetargserasnileglnthrarg

505560

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65707580

servalglnalaglyglnargleuasnvalpropheprocysaspcys

859095

ileaspglyglnpheleuglyhislysphesertyraspvalgluthr

100105110

glyaspthrtyrgluthrvalalathrasnasntyralaasnleuthr

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asnvalglutrpleuargargpheasnthrtyrproproasnaspile

130135140

proaspthrglythrleuasnvalthrvalasncyssercysglyasp

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alaaspvalglyasntyralaleuphevalthrtyrproleuargpro

165170175

glygluthrleuvalservalalaasnserserlysvalaspserser

180185190

leuleuglnargtyrasnproglyvalasnpheasnglnglysergly

195200205

ilevalphevalproglylysaspglnasnglyserphevalpheleu

210215220

glyserserserglyleuglyglyglyalaileglyglyilealaval

225230235240

glyilevalvalvalleuleuleuvalalaalaalailetyrphegly

245250255

tyrphearglyslyslysileglnlysglugluleupheserargasp

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serthralaleupheserglnaspglylysaspgluasnserhisgly

275280285

alaalaasnvalthrglnargproglyvalmetthrglyilethrval

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asplysservalgluphesertyraspgluleualaalaalaserasp

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asnphesermetalaasnlysileglyglnglyglypheglyserval

325330335

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valhishisleuasnleuvalargleuileglytyrserileglugly

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serleupheleuvaltyrglutyrilegluasnglyasnleusergln

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hisleuargglyserglyargaspproleuprotrpalathrargval

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glnilealaleuaspseralaargglyleuglutyrilehisgluhis

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thrvalprovaltyrilehisargaspilelysproalaasnileleu

435440445

ileasplysasnpheargglylysvalalaasppheglyleuthrlys

450455460

leuthrgluvalglyserserserleuprothrglyargleuvalgly

465470475480

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prolysvalaspvaltyralapheglyvalvalleutyrgluleuile

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lysglyleuvalglyleuphegluglyvalleuserglnproasppro

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thrgluaspleuarglysilevalaspproargleuglyaspasntyr

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proalaaspservalarglysmetalaglnleualalysalacysthr

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glngluasnproglnleuargprosermetargserilevalvalala

580585590

leumetthrleuserserthrthraspasptrpaspvalglyserphe

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tyrgluasnglnasnleuvalasnleumetserglyarg

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<210>32

<211>623

<212>prt

<213>百脉根

<400>32

metlysleulysthrglyleuleuleuphepheileleuleuleugly

151015

hisvalcysphehisvalgluserasncysleulysglycysaspleu

202530

alaleualasertyrtyrileleuproglyvalpheileleuglnasn

354045

ilethrthrphemetglnsergluilevalserserasnaspalaile

505560

thrsertyrasnlysasplysileleuasnaspileasnileglnser

65707580

pheglnargleuasnilepropheprocysaspcysileglyglyglu

859095

pheleuglyhisvalpheglutyrseralaserlysglyaspthrtyr

100105110

gluthrilealaasnleutyrtyralaasnleuthrthrvalaspleu

115120125

leulysargpheasnsertyraspprolysasnileprovalasnala

130135140

lysvalasnvalthrvalasncyssercysglyasnserglnvalser

145150155160

lysasptyrglyleupheilethrtyrproileargproglyaspthr

165170175

leuglnaspilealaasnglnserserleuaspalaglyleuilegln

180185190

serpheasnproservalasnpheserlysaspserglyilealaphe

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ileproglyargtyrlysasnglyvaltyrvalproleutyrhisarg

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thralaglyleualaserglyalaalavalglyileserilealagly

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thrphevalleuleuleuleualaphecysmettyrvalargtyrgln

245250255

lyslysglugluglulysalalysleuprothraspilesermetala

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leuserthrglnaspglyasnalaserserseralaglutyrgluthr

275280285

serglyserserglyproglythralaseralathrglyleuthrser

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ilemetvalalalyssermetgluphesertyrglngluleualalys

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alathrasnasnpheserleuaspasnlysileglyglnglyglyphe

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340345350

lysmetaspvalglnalaserthrglupheleucysgluleulysval

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leuthrhisvalhishisleuasnleuvalargleuileglytyrcys

370375380

valgluglyserleupheleuvaltyrgluhisileaspasnglyasn

385390395400

leuglyglntyrleuhisglyserglylysgluproleuprotrpser

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serargvalglnilealaleuaspalaalaargglyleuglutyrile

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hisgluhisthrvalprovaltyrilehisargaspvallysserala

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asnileleuileasplysasnleuargglylysvalalaaspphegly

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leuthrlysleuilegluvalglyasnserthrleuglnthrargleu

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<211>620

<212>prt

<213>蒺藜苜蓿

<400>33

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leualasertyrtyrileileproserileglnleuargasnileser

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505560

metsertyrasnargaspvalvalpheasplysserglyleuileser

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tyrthrargileasnvalpropheprocysglucysileglyglyglu

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pheleuglyhisvalpheglutyrthrthrlysgluglyaspasptyr

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aspleuilealaasnthrtyrtyralaserleuthrthrvalgluleu

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leulyslyspheasnsertyraspproasnhisileprovallysala

130135140

lysileasnvalthrvalilecyssercysglyasnserglnileser

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lysasptyrglyleuphevalthrtyrproleuargseraspaspthr

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asnpheserleuaspasnlysileglyglnglyglypheglyalaval

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valhishisleuasnleuvalargleuileglytyrcysvalglugly

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<213>玉米

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alaileleuvalleuglyvalleuleutyrilemetphetyrargarg

245250255

lyslysalaasnlysalaalaleuleuprosersergluaspserthr

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275280285

alaaspserserserglyvalproglyilethrvalasplysserval

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gluphesertyrglugluleupheasnalathrgluglyphesermet

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leuargglyglulysalaalailelyslysmetaspmetglnalaser

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hisglupheleualagluleulysvalleuthrhisvalhishisleu

355360365

asnleuvalargleuileglyphecysthrgluserserleupheleu

370375380

valtyrglupheilegluasnglyasnleuserglnhisleuarggly

385390395400

thrglytyrgluproleusertrpalaalaargvalglnilealaleu

405410415

aspseralaargglyleuglutyrilehisgluhisthrvalproval

420425430

tyrilehisargaspilelysseralaasnileleuileasplysasn

435440445

tyrargalalysvalalaasppheglyleuthrlysleuthrgluval

450455460

glyasnthrserleuprothrargglyilevalglythrpheglytyr

465470475480

metproproglutyralaargtyrglyaspvalserprolysvalasp

485490495

valtyralapheglyvalvalleutyrgluleuileseralalysasp

500505510

alailevalargserthrgluserserseraspserlysglyleuval

515520525

tyrleuphegluglualaleuasnthrproaspprolysgluglyleu

530535540

glnargleuileaspproalaleuglygluasptyrproileaspser

545550555560

ileleulysmetthrvalleualaargalacysthrglngluasppro

565570575

lysalaargprothrmetargserilevalvalalaleumetthrleu

580585590

serserthrsergluphetrpaspmetasnalaileglngluasngln

595600605

glyvalvalasnleumetserglyarg

610615

<210>35

<211>626

<212>prt

<213>大麦

<400>35

metglualaproleuhisserleuleuleuleuleuleuleualaala

151015

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202530

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354045

valthrtyrilealaserleupheglypheserglutyrargvalleu

505560

glyglntyrasnproglyvalasnasnleuasptyrvalvalalagly

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aspargleuasnvalserleuthrcyslyscysleualaserleuser

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alaproalaserthrpheleualaalaserileprotyrlysvalala

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proglulysmetaspleuleulyslystyrasnproglymetaspgly

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sertyrargproleugluserproglylyslysserseralaglyala

225230235240

ilealaglyglyvalvalalaglyvalvalalaleuvalleuglyval

245250255

valleupheleuphetyrargargarglysalalyslysaspalaleu

260265270

leuproserserglugluserthrargleualaseralailesermet

275280285

glnlysvalthrproserthrserglnalaaspglyalaserproala

290295300

alaglyilethrvalasplysservalgluphesertyrglugluleu

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325330335

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340345350

ilelyslysmetaspmetglnalathrglnglupheleualagluleu

355360365

lysvalleuthrhisvalhishisleuasnleuvalargleuilegly

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tyrcysthrgluserserleupheleuvaltyrglupheilegluasn

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glyasnleuserglnhisleuargglythrglytyrgluproleuser

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420425430

tyrilehisgluhisthrvalprovaltyrilehisargaspilelys

435440445

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465470475480

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485490495

tyrglyaspvalserprolysvalaspvaltyralapheglyvalval

500505510

leutyrgluleuileseralalysaspalailevalargseralaglu

515520525

serthrseraspserlysglyleuvaltyrleuphegluglualaleu

530535540

seralaproaspprolysgluglyileargargleumetaspprolys

545550555560

leuglyaspasptyrproileaspalaileleulysmetthrhisleu

565570575

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580585590

servalvalvalalaleumetthrleuserserthrsergluphetrp

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alaleuaspseralalysglyileglutyrilehisasptyrthrlys

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<213>蒺藜苜蓿

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ileilepheileleuargargasnlysalatyrgluthrserlystyr

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<213>百脉根

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<212>prt

<213>粳稻组

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<213>拟南芥

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tyrvalphethralaasnasncysvallyscysthrcysaspalaleu

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<213>蒺藜苜蓿

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pheglypheaspgluleuvalglualathraspglypheaspgluarg

340345350

pheleuileglnglyservaltyrlysglygluileaspglyglnval

355360365

tyralailelyslysmetlystrpasnalatyrglugluleulysile

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<212>prt

<213>玉米

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leuasnleualaalaileglyaspleuphealaalaserargphemet

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asnasnalaseralathrproalaalaproproproseralaserpro

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asnalathrvalvalargasnaspargasnglyvalvalthrglyleu

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alavalglyleuglyvalvalglyalaleutrpleuleuglnmetleu

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glyserseralaalaalaalaglyglyglygluargpheleuvalser

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aspmetserglutrpleuasplystyrargvalphethrvalgluglu

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alaalaasnalavalproservalserproleualaproserserleu

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hisasnsersertyrthrileglnpheargglygluthrtyrpheile

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ilealaasnilethrtyrglnglyleuthrthrcysglnalaleuile

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leuthrvalproleuargcysalacysproserproalaglnalaala

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argalaargargargglnargleuprovalglygluservalarggln

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glyserlysvalvalileaspvalserserseralaasptyrglyala

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leualaserglylyslysilethrasnthrthrthrsersermetser

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seralaalatrpserleuvalalaseraspvalargglyalavalglu

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580585590

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arg

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<213>大麦

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355360365

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370

再多了解一些
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