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用于检测微生物和病毒颗粒的方法和组合物与流程

文档序号:24891614发布日期:2021-04-30 13:18
用于检测微生物和病毒颗粒的方法和组合物与流程
本发明涉及微生物和病毒颗粒的检测,具体地粗样品中微生物或病毒颗粒的检测。
背景技术
:需要例如用于微生物或病毒感染诊断的快速、简化和成本相对较低的分子诊断测试以在偏远地区需要的时候使用。一个最近的相关实例是2014年刚果金(drc)的埃博拉病毒(ebola)爆发以及所述地区当前正在发生的疫情。在这些环境中的关键是对患者进行快速分类的能力,使得可以将真正受到感染的患者与因如疟疾等其它原因而发热的患者隔离开来。由于如埃博拉病毒等病毒性出血热具有极强的传染性,因此在野战医院环境中迅速正确地对患者进行分层至关重要。同样重要的是绝对要求通过最小化暴露于在这种情况下通常用于分子测试的受感染患者血液来最大化操作人员的安全。病原体诊断通常是在对样品进行了核酸提取以便纯化任何靶病原体核酸后进行的,并且所述核酸提取对实验室工作人员来说是主要的危险点。因此,需要一种使用最少的实验室设施并且无需熟练的操作人员的简单、生物安全的方法。通常,用于筛选高防护水平病原体(如埃博拉病毒)的存在的分子方法需要附加水平的生物安全性,以保护实行测试的操作人员。筛选这些病毒性出血热的第一步是从患者那里抽取静脉血。采集样品的个体通常会穿着全面的个人防护装备,包含多副手套、防护服和口罩。采集血液样品后,通过浸泡在漂白剂以及然后杀病毒剂(例如异硫氰酸胍)中来对收集容器的外部进行消毒,以在进行核酸提取之前使病毒不具传染性。这些已知方法包含多步骤程序,并且因此需要训练有素的使用者并可以进入实验室。用于此类测试的静脉抽取液的典型体积为3-6ml,因此,考虑到必须进行多次液体转移和取下瓶盖,暴露于病原体的风险很高。如果体积较小,如可以直接处理较小体积的血液,则可以将此暴露风险降到最低。如果要处理较小体积的样品(例如血液),以最大程度地提高操作人员的安全性,那么灵敏度的要求就会增加。世界卫生组织研发蓝图(https://www.who.int/blueprint/en/)将3,000病毒体/ml全血的水平定义为适合发展中国家进行低成本诊断的检测水平。这将有可能检测多种疾病,包括hiv和丙型肝炎,并且包含上文所述的病毒性出血热(埃博拉病毒、拉沙热(lassa)、马尔堡病(marburg)、里夫特裂谷热(riftvalleyfever)、克里米亚刚果热(crimeancongofever)、尼帕(nipah)、黄热病(yellowfever)、登革热(dengue)等)。3,000病毒体/ml的数字将提供检测下限的要求,并为直接添加到反应中所需的血液量提供引导,因为3,000/ml是每微升3个病毒靶标。目前的方法需要改进以便于更安全地检测病原体,特别是在使用安全设备受到限制的情况下如在某些第三世界国家,这与某些最致命的病原体的高发率相吻合。血液是通常用于诊断的潜在病原体的易于获取和常用来源。通常经由基于pcr的诊断(包含rtpcr)检测病原体。然而,pcr典型地受到全血存在的抑制,无论是酶扩增过程和用于检测存在呈pcr某些形式如rtpcr的pcr产品的光学器件。全血含有抑制剂,如血红素、铁、免疫球蛋白和其它抑制剂,所述抑制剂会抑制进行pcr所需的聚合酶或从rna靶标扩增所需的逆转录酶。同样,实时过程中使用的荧光团被血液中如血红素的物质淬灭,并且血液本身具有自己的吸取光谱和发射光谱,最终结果是,在高浓度的血液的存在下,实时pcr被认为是不可靠的。灵敏度的责任(特别是在使用低体积的血液时)是指,血液必须在pcr中占总反应体积的较大百分比,并且将达到由于反应不透明,因此无法再实行实时pcr的点。鉴于上述内容,使用血液样品基于pcr的诊断通常需要多个步骤,例如去除红细胞使得血浆或血清可以进入pcr反应,提取病原体核酸使得在裂解物中没有任何抑制剂的情况下可以进行pcr,和/或提取所得pcr产物使得在不存在红细胞的情况下可以进行检测。这些多个步骤需要实验室设备、生物安全的环境和安全设备,以确保临床从业人员和实验室人员不会受到感染,这意味着检测并不简单,并且不适合于病原体的基于现场的快速检测。众所周知,全血的存在会抑制pcr,因此鲜有同行评审的直接从血液qpcr的论文,因为在完全光学抑制该过程之前,只可以将非常低量的血液添加到反应中。可以添加的血液量和所述方法的相对小的体积(<50ul)意味着直接从血液病原体检测的描述很少。对于标准qpcr,minogue等人(minogue、timothyd等人“用于直接测试含有生物战剂dna的气溶胶和血液样品的抗抑制剂pcr试剂的跨机构评估(cross-instituteevaluationsofinhibitor-resistantpcrreagentsfordirecttestingofaerosolandbloodsamplescontainingbiologicalwarfareagentdna)”《应用和环境微生物学(appliedandenvironmentalmicrobiology)》第80卷,4(2014):1322-9.)描述了将孢子直接掺入全血中,但这仅达4%,并且关键是没有描述任何旋转步骤。关于直接从血液逆转录qpcr的文献很少,因为关于在血液存在下使用逆转录酶的文献更少。确实存在的那些集中于如疟疾的寄生虫,其中大量的核糖体rna可以用作pcr靶标,例如每个寄生虫可以有成千上万的核糖体rna转录本(taylorbj、lankek、banmansl等人“直接从血液逆转录酶聚合酶链反应测定法监测消除环境中恶性疟原虫的传播(adirectfrombloodreversetranscriptasepolymerasechainreactionassayformonitoringfalciparummalariaparasitetransmissionineliminationsettings)”.《美国热带医学与卫生杂志(amjtropmedhyg.)》2017;97(2):533-543),或每个病毒(像埃博拉病毒)可以有成千上万的核糖体rna转录本,在病毒的情况下,病毒滴度可能为每毫升全血数百万(kavitshah、emmabentley、adamtyler、kevinsrichards、edwright、lindaeasterbrook、dianelee、clairecleaver、louiseusher、janeeburton、jamespitman、christinebbruce、davidedge、martinlee、nelsonnazareth、davidanorwood、sterghiosathanasiosmoschos.“可现场部署、定量、快速鉴定未处理血液中的活性埃博拉病毒感染(field-deployable,quantitative,rapididentificationofactiveebolavirusinfectioninunprocessedblood)”.《化学科学(chem.sci.)》,2017;doi:10.1039/c7sc03281a)。全血对pcr的抑制已经显示是多因素,所述因素有存在含血红素化合物的铁、免疫球蛋白以及简单地由于血液中存在竞争阳离子如钙(sidstedt、maja等人“数字和实时pcr中血红蛋白、免疫球蛋白g和全血的抑制机制(inhibitionmechanismsofhemoglobin,immunoglobuling,andwholebloodindigitalandreal-timepcr)”《分析和生物分析化学(analyticalandbioanalyticalchemistry)》第410卷,10(2018):2569-2583)。裂解细胞如血细胞的方法是已知的,例如从wo2011157989中获知。然而,wo2011157989的方法需要大量能量以允许所需的冷冻和解冻循环。此类方法不适合于使用电池供电的pcr机的基于现场的病原体检测。wo2016139443公开了直接在血液样品上实行pcr的方法。然而,这种方法限于在每个pcr反应中使用相对低量的血液,这意味着灵敏度受到限制,并且还限于特定的激发和发射波长。这些波长与大多数常用的荧光团不相关,但确实存在合适的荧光团组合,如cy5-bhq2、hilyte647-qxl607,从而限制了复用的潜力。鉴于此,低价、简单且适合于在通电受限的现场使用的病原体检测的单步、封闭管、基于pcr的方法,特别是从血液样品中,并不可用。任何能够处理全血的仪器或测定法(如biofire或smartcycler)都需要上游处理,并且由于其对核酸提取过程自动化的绝对要求,它们的性质更加复杂,因此每次测试都非常昂贵。bg研究(bgresearch)先前已经描述了用于直接裂解来自粗样品的细胞和病毒的方法,wo2011157989kavitshah等人“可现场部署、定量、快速鉴定未处理血液中的活性埃博拉病毒感染(field-deployable,quantitative,rapididentificationofactiveebolavirusinfectioninunprocessedblood)”.《化学科学(chem.sci.)》,2017;doi:10.1039/c7sc03281a),和相关的光学系统,所述光学系统使得在全血的存在下复用的实时pcr进行成为可能,wo2016139443。wo2011157989中所描述的方法导致冰晶损害(以病毒为例),如细胞解冻的渗透压休克(以真菌为例)以及因为两者都用于更复杂的靶标(如孢子和细菌),这使得生物体可以检测。然而,冷冻过程增加了所述方法的时间,并且由于在现场这些机器使用电池电力来运行,因此冷冻/解冻会大量消耗电力。因此,本发明提供了试剂和方法,所述试剂和方法使得可以对感染如埃博拉病毒等患者进行现场诊断检测,从而减少了检测时间、操编辑暴露于病原体,并且消除了对训练有素的操作人员以及爆发区中实验室的建立的要求。然后将清楚的是,本发明在响应于疾病的新爆发而直接检测来自粗样品的病原体方面具有特殊用途。本发明适用于各种粗样品类型和病原体家族。进一步地,有可能快速开发出用于满足对新出现的疾病爆发作出反应的要求的新测定方法,即,用于适合任何特定病原体的检测的优化方法和试剂。由于所述技术基于久经考验的rt-qpcr过程,因此关键的优化步骤是确定热过程,所述热过程与所描述的试剂组合可以裂解并扩增任何新近遇到的病原体。然而,根据本说明书将清楚的是,预期本发明的某些实施例不需要优化,并且可以如所描述的那样用于检测新兴病原体的感染。申请人已经发现通过使用本文所述的方法可以大大增加粗样品的量,例如可以添加到反应中的血量。在全血的情况下,此量超过35%。这具有增加诊断灵敏度而且还使反应的最终体积降到最低的综合好处,因此允许更快的热循环,并且从而减少检测时间,这就现场护理环境而言至关重要。另外,它通过减少总反应体积并因此成比例地降低了试剂的成本而大大降低了每次测试的成本。在偏远、资源匮乏的环境中发现了许多血液传播的病毒感染,包含拉沙热、cchf、埃博拉病毒等,因此最短的检测时间、易用性和每次检测的成本都是至关重要的。世界卫生组织研发蓝图指出,针对发展中国家的简化分子诊断方法必须具有3000病毒体/ml的灵敏度,且每次测试的成本必须等同于基于抗体的方法。本发明实现了这一点,将灵敏度提高到低于1000病毒体/ml,并降低了侧流免疫诊断的成本。已经表明使用所述方法的测定法能够检测到每个反应少至15个病毒体,因此假设已经添加了15ul血液,这将是1000病毒体/ml的最终灵敏度。在样品是血液样品的情况下,申请人已经发现,基于变量(如ph值)和补充物的存在,某些试剂混合物可能更会使血液变性。这样的结果是,wo2016139443(其描述了一种基于高功率激光的基于光谱学的方法用于在全血存在下进行多重检测)中描述的光学系统在那些情况下不再能够检测血液浓度高达所述申请中表述的13%最大值中的实时pcr信号(kavitshah、emmabentley、adamtyler、kevinsrichards、edwright、lindaeasterbrook、dianelee、clairecleaver、louiseusher、janeeburton、jamespitman、christinebbruce、davidedge、martinlee、nelsonnazareth、davidanorwood、sterghiosathanasiosmoschos.“可现场部署、定量、快速鉴定未处理血液中的活性埃博拉病毒感染(field-deployable,quantitative,rapididentificationofactiveebolavirusinfectioninunprocessedblood)”.《化学科学》,2017;doi:10.1039/c7sc03281a)。这种性能降低的原因是,在变性程度更高的试剂中,血液从红色液体变成变性蛋白质的“棕色”胶体悬浮液,从而增加了液体的不透明度。在较高百分比的血液下,形成了深棕色的胶体悬浮液,所述悬浮液会完全阻止光学数据的收集。尽管申请人已经能够配制能够在多达40%的全血存在下实行逆转录定量pcr(rt-qpcr)的试剂,但是该过程不可行,因为无法再识别光学数据。技术实现要素:本发明提供了用于处理和检测样品中的微生物和病毒颗粒的改进的试剂和方法。当所述样品是如全血等粗样品时,本发明是特别有利的。本发明的方法通常涉及:处理步骤,其中病毒或微生物核酸通过例如标准rt-pcr反应变得可扩增;后续扩增步骤,其中任何靶核酸被扩增;以及检测步骤,其中检测经过扩增的核酸。所述方法可以与本领域已知的任何荧光团或合适的扩增子检测染料或实时pcr化学物质一起使用,因为可以使用任何激发和检测波长。这改善了可以同时筛选的靶核酸靶标(在这种情况下是来自全血的病原体)的数量。本方法也不需要像某些先前方法那样的核酸提取步骤或离心,这意味着本方法更简单,需要的实验室设备更少并且样品的处理更少。在一些实施例中,所述方法还涉及多轮逆转录(rt)。已证明这可以大大增强反应的敏感性,并且可以直接从如血液等粗样品中检测到非常低丰度的病毒的存在。所述方法可以与pct/gb2019/051156的教导组合以用作系统,所述系统用于直接检测全血中的病毒病原体,有效地在封闭管中制备血浆,裂解其中含有的病原体,并且然后直接对所关注的靶病原体进行rt-qpcr,在离心步骤之后可以实行任选的冻融周期(ep2585581),因此使得可直接扩增多种靶病原体。具体实施方式在一个方面,本发明提供了一种制备样品以用于直接扩增所述样品中可能存在的靶微生物或病毒核酸的方法。本发明人已经发现,尽管在某些情况下加热样品可能足以获得pcr试剂可接近的并且可以被扩增的核酸,但是仅加热是不可靠的,并且通常不能广泛应用于不同的靶微生物或病毒。特别是在样品是粗样品的情况下,例如从受试者获得的粗样品如血液样品,所述粗样品本身通常可以包括抑制pcr反应的化合物。因此,在一个方面,本发明提供了一种制备样品以用于通过聚合酶直接扩增微生物或病毒颗粒核酸的方法,所述样品获自受试者、可以含有一种或多种微生物或病毒颗粒,其中所述方法包括在包括洗涤剂、溶剂和一种或多种核酸聚合酶的试剂的存在下将所述样品在容器中加热到至少70℃的温度。当前的病原体诊断方法通常在样品的核酸提取(例如盐/醇提取)以便纯化任何靶病原体核酸之后进行。这通常要求使用专用的实验室设施和训练有素的分子生物学家,因此不适合应对新兴病原体的爆发,特别是在那些使用先进的实验室设备受限的国家或地区。进行核酸提取的原因有两个,首先是为了确保破坏病原体以便释放靶核酸,其次是为了去除样品中存在的可能对分子诊断测定性能产生不利影响的抑制剂,如pcr抑制剂。为了进行直接诊断,因此有必要在单个封闭管过程中完成此二重功能。必须裂解病原体/使得可以检测到核酸,并且试剂必须能够在存在足够粗样品的情况下进行扩增过程以使得能够进行诊断检测。例如,以埃博拉病毒为例,有症状的个体的病毒载量将超过1e6病毒体/ml血液并且病毒载量与疾病的严重程度和伴随的死亡风险直接相关,这意指每微升全粗血将含有1000个基因组靶标并将具有诊断效用(hartleyma、younga、tranam、okoni-williamshh、sumam等人(2017)“预测埃博拉病毒严重程度:埃博拉病毒疾病的临床优先级评分(predictingebolaseverity:aclinicalprioritizationscoreforebolavirusdisease)”.《公共科学图书馆·被忽视热带病(plosneglectedtropicaldiseases)》11(2):e0005265.)。世界卫生组织定义3000病毒体/ml的灵敏度水平适合用于偏远贫困地区的简单、低成本测试。作为实例,在发展中国家环境中,在病毒载量可能低于10,000病毒体/ml的情况下,这将足以检测出重要的疾病,如丙型肝炎和hiv。结果在这些情况下,有必要处理大量的粗样品,因为每微升仅含有3个基因组靶标区域。当目标是检测病毒病原体的存在时,此方法的优选样品类型是全血,并且血清和血浆通常是分子生物学实验室使用的样品类型。通常使用血浆和血清,因为它们避免了提取过程中可能产生并且因此会产生假阴性结果的抑制性化合物。使用血清和血浆的缺点在于使用的离心可能降低样品中的病毒滴度(klungthongc、gibbonsrv、thaisomboonsukb等人“使用全血进行逆转录酶pcr和分离病毒来进行登革热病毒检测(denguevirusdetectionusingwholebloodforreversetranscriptasepcrandvirusisolation)”.《临床微生物学杂志(jclinmicrobiol.)》2007;45(8):2480-5.)。因此,用于直接检测样品如血液中存在的微生物或病毒病原体的理想方法是将样品(如一定体积的全血)直接添加到密封的反应容器中,以最大化生物安全性和灵敏度,从而确保存在于任何微生物或病毒中的核酸变得可扩增并进行直接扩增。可扩增包含以下意义:使微生物或病毒内部的核酸可接近pcr组分如引物和一种或多种聚合酶;并且任何扩增抑制剂的影响都被充分缓解,使得在容器环境下存在的核酸能够被扩增,例如能够通过pcr或逆转录pcr(rt-pcr)或实时(rt)pcr(rtpcr)或定量(q)pcr(qpcr)或逆转录定量pcr(rt-qpcr)进行扩增。“直接扩增”包含以下意义:按照制备样品的方法,可以对样品进行扩增,例如pcr或rt-pcr或rt-qpcr,即,无需进一步处理核酸;并且如果扩增所需的所有组分已经存在或已添加到样品中,则可以进行扩增。直接扩增还包含以下意义:在处理后无需从样品中去除任何组分,即,不必例如离心样品并去除粒状材料或可能被认为包括扩增抑制剂的其它级分。在一个优选实施例中,容器包括扩增所需的所有组分,使得一旦将样品添加到容器中,就可以进行扩增。一旦添加了样品,在一些实施例如容器包括扩增和检测所需的所有组分的那些实施例中,就将容器密封并且不需要再次打开。当所述方法制备用于直接扩增病毒或微生物核酸的样品时,本发明的方法在检测高致病性微生物和病毒中特别有用。在这些情况下,尽可能减少临床医生/现场工作人员暴露于病原体是至关重要的。本发明提供了一旦已经将样品采集并添加到容器中,临床医生/现场工作人员就不需要暴露于任何病原体。在一些实施例中,所述方法是制备样品的封闭管方法。技术人员将理解封闭管方法的含义,并且通常要求一旦将样品与制备方法或下游扩增和检测步骤的任何必要组分一起添加到容器中,就将容器封闭,例如通过将盖封闭或将盖子密封到容器上,并且盖或盖子不会再次打开。例如,在封闭管方法的一些实施例中,不添加另外的材料或从容器中去除另外的材料,例如,不提取核酸或不以任何方式纯化核酸。因此,在一个实施例中,不提取微生物或病毒核酸,例如微生物或病毒核酸不用醇进行沉淀,例如不用乙醇进行沉淀。技术人员将理解核酸提取的含义,并且通常是从其环境中纯化核酸。因此,在此实施例中,核酸不从其原始环境中去除,即,不从样品和试剂的其它组分中去除。在此实施例和其它实施例中,核酸未纯化,即,未与细胞或病毒的其它组分分离。在相同或不同的实施例中,在制备步骤的任何阶段,不从容器中去除样品或试剂的任何部分,例如,不从容器中去除样品或试剂的任何部分:a)在所述加热之前;和/或b)在所述加热之后。在一个实施例中,一旦将样品添加到容器中,就不从容器中去除任何材料。在另外的实施例中,在制备、扩增和检测过期间不从容器中去除任何材料。在此类实施例中,可以使用包括不可逆锁的容器,使得一旦添加了样品并且密封了容器,就不能再次打开容器。在pct/gb2019/051156中对此类容器进行了描述。在一个实施例中,容器被认为是生物安全容器。技术人员将理解术语生物安全的含义。在一个实施例中,生物安全意指容纳在容器中的病原体都不能够从容器中逸出,因此处理容器的人员不会暴露于容纳于其中的任何病原体。在一个实施例中,生物安全容器具有锁定的盖子或盖。优选地,生物安全容器由防压材料制成,如碳载聚合物。在另一个实施例中,生物安全容器在密封方面还具有2个安全点。在一个优选实施例中,本发明的容器适合用于扩增反应,例如pcr反应,任选地适合用于逆转录(rt)pcr,任选地用于定量(q)pcr或rt-qpcr。适合用于此类反应的容器通常具有厚度为大约0.5到0.8mm并由碳载聚合物制成的薄壁。这解决了2件事:1)使其更快地吸取和损失热量;2)减少反应容器保持器/试管/液体内容物之间的滞后。制备用于扩增的样品的一些已知方法涉及反复冻融样品。尽管此类方法适用于本发明的方法,但是无需冷冻样品。这是本发明相对于此类方法的一个优点,因为冻融是能源密集型的,这意味着此类方法不是最适合现场使用的,例如在热循环仪由电池供电的情况下在难以接通市电的国家。本发明解决了这个缺点。因此,在一个实施例中,相对于环境温度,样品的温度未降低,任选地其中样品未冷冻。用于制备用于核酸扩增的样品的其它手段涉及样品的离心,所述离心可以:a)减少干扰扩增子检测的颗粒物质;以及b)减少可以包括pcr抑制剂的材料。然而,正如冷融方法,离心需要另外的实验室设备和能量。如上文所讨论的,离心还可以去除一些病毒或微生物物质,这意味着在扩增中可用作模板的靶核酸较少。本发明更简单、能耗小、技能要求低,并且解决了微粒物质干扰分光光度计的光路和扩增抑制的问题。通过选择一种或多种合适的聚合酶,例如选择对血液或尿液或唾液中存在的抑制剂具有耐受性的酶,可以在某种程度上减轻扩增的抑制作用。技术人员将了解耐受特定样品类型的酶,并且还将了解如何确定用于与给定样品类型一起使用的最合适的酶。因此,在一个实施例中,样品未离心:a)在加热之前;和/或b)在所述加热之后。然而,在一些情况下离心是合适的,例如简单地将可能凝聚在容器盖上的样品和试剂拉入容器中。例如,可以将样品以1-2000g的速度脉冲离心,例如持续5秒到15秒以简单地将凝聚物下拉到容器中。优选地,样品是粗样品。粗样品包含以下含义:未添加或添加最少另外组分和/或在从受试者获得样品后应用改变样品组成的处理步骤的样品。例如,粗样品可以是粗生物样品,如a)血液,任选地全血;b)尿液;c)血清;d)血浆;e)粪便,f)脑脊髓液;g)拭子,任选地来自眼睛、耳朵、鼻子或嘴巴的拭子;和/或h)从拭子的洗涤中获取的洗脱液。在一些示例性实施例中,可以将取自人和动物或环境表面或另一种固体样品类型的拭子放置在水(例如200ul水)中并旋涡以释放病毒或微生物颗粒。然后可以将水以至多反应体积的20%添加到容器中。类似地,可以将液态环境样品直接添加到容器中。技术人员将理解粗样品的含义。在一个实施例中,粗样品是其中没有尝试从其天然环境中纯化靶核酸的样品,例如从血细胞、尿液样品、粪便样品、脊髓液或拭子中纯化。从拭子的洗涤中获取的洗脱液被认为是粗样品,因为在此阶段的靶核酸仍可能与细胞物质或病毒颗粒有关。由于本发明还可以应用于动物疾病的检测,因此使用拭子或拭子洗脱液作为样品的能力很重要。在兽医领域,最普遍使用的样品类型是拭子-这些拭子根据所怀疑的疾病从眼睛、鼻子或嘴巴中获取。许多毒性动物病原体如牛瘟和pprv具有病毒学组分,但是对于一些具有重要经济意义的疾病,可以在血液中发现病毒病原体的时间窗口非常有限。然而,在这些疾病很普遍的偏远、资源匮乏的环境中使用直接血液法有许多缺点。首先,从动物身上获取血液样品需要训练有素的兽医的输入,其次,病毒可以在非专业人员可以获取的易于获得的样品中找到。本申请涵盖了一种用于实行病毒性动物病原体的直接检测且无需借助核酸提取的方法,所述病毒性动物病原体直接来自从嘴巴、眼睛或鼻子中获取的拭子样品。本申请人还已经认识到这可以应用于其它重要疾病,例如人类的呼吸疾病。简单地从患者或动物身上获取拭子,将所述拭子放入含有200ul水的塑料管中,并且然后摇晃塑料管以释放拭子中的病毒颗粒。然后将一小部分此液体直接转移到反应容器中代替血液或先前描述的其它液体样品类型。粗生物学样品被认为是直接取自生物体的任何样品。尽管本发明被认为在诊断病原体感染方面具有主要用途,但是粗样品还可以是粗环境样品,在所述情况下,权利要求书中的“受试者”可以认为是指环境样品的表面或来源。粗环境样品包含以下含义:样品如食物样品、取自如表面等环境的拭子以及不是直接取自生物体的任何其它样品类型(在所述情况下,它将被认为是直接取自生物体的粗生物样品)。粗样品还可以是直接粗环境样品,例如来自溪流或湖泊的直接水样品、直接土壤或其它环境材料样品。样品还可以是植物样品。粗样品也可以是在获得样品后已对其施加最少处理的样品,如在从全血制备血浆和血清,或从拭子的洗涤中获取的洗脱液,例如对于对操作人员没有高度传染性的病原体,例如当在现场用于检测兽医病原体时。粗样品还可以已经添加了一些另外的组分,例如防腐剂,但这些组分不认为是由于从样品中纯化核酸而产生的,换句话说,样品中所有原始材料仍然存在。在血液样品的情况下,可以将edta添加到样品中进行储存,但样品仍被认为是粗样品。可以在根据本发明的方法制备之前将拭子和样品冷冻,但是优选地,一旦已经从受试者获取样品,就马上或尽快对所述样品实行所述方法,以至少使污染和感染最小化。如所讨论的,经过处理的样品通常用于扩增反应以扩增靶核酸。然后,在扩增之后或在扩增期间,例如使用qpcr或rt-qpcr,检测经过扩增的靶标或扩增子。技术人员将理解,qpcr和rt-qpcr通常需要使用荧光团或其它合适的核酸嵌入或检测染料和探针化学物质。技术人员将理解qpcr的含义。在这种情况下,当靶病原体具有高水平的序列异质性时,反应含有引物或引物组,例如拉沙热,以及对所关注的靶序列特异的探针。这可能是水解探针,其中5末端标记有荧光团,而3则标记有淬灭部分-在扩增期间,探针被酶水解,因此荧光逐周期增加。提供了激发装置,并且通过容器中的窗口捕获了所产生的发射,所述窗口在一些实施例中位于盖中。在一些优选的实施例中,荧光团或染料在处理步骤期间存在,例如作为荧光团标记的引物或探针的一部分。粗样品通常将包括微粒或细胞材料,其在一些实施例中可以被认为干扰荧光团的激发和/或捕获发射的波长并且可能以其它方式干扰合适的荧光团的选择。避免这些问题的已知方法涉及离心和/或使用特定的荧光团组合,所述荧光团组合在未被样品吸取的波长(例如未被血液吸取的波长)下激发和发射,例如远红外荧光团。然而,本方法中使用的试剂解决了此类问题,因为它引起样品如全血的聚集或凝结,从而形成大量下沉于血管底部的沉积物。本发明特别适用于全血样品,尽管所提供的试剂将使任何富含蛋白质的样品中的蛋白质材料下沉。如果容器基本上没有受到干扰或搅动,则沉积物就保留容器的底部处,留下可以用于荧光团激发和发射的澄清顶层。因此,在任何波长下都可激发和发射的荧光团或染料可以与本发明一起使用,而无需离心步骤。例如,样品可以在介于300nm与800nm之间的波长下激发,并且可以在任何波长(例如介于300nm与800nm之间)下收集发射的光。在一些实施例中,用于激发与qpcr相关联的荧光团的激发波长介于630nm-645nm之间,任选地介于633nm-642nm之间;和/或在介于650nm-750nm之间的波长下收集发射的光。在另一个实施例中,在大约475nm和/或635nm的波长下激发荧光团;和/或在大约520-50nm和660-750nm的波长下收集发射的光。在一个实施例中,pcr使用2色系统,所述2色系统具有在475nm和635nm下的led激发并且使用具有520-580nm和660-750nm的窗口的双带通滤光器在400-900nm下收集发射。示例性荧光团包含fam、tet、joe、vic、hex、ned、pet、rox、tamra、cy5。然而,技术人员将理解由于在本方法中样品不干扰激发或发射,因此合适的荧光团或染料的选择仅受所使用的热循环仪的激发和收集能力的限制。尽管本发明不要求,但是可以对样品进行离心步骤,这在某些情况下可能是有益的。例如,通过进行离心步骤,可以从光路中更快地去除粗样品,例如血液。如果获得样品并直接添加到容器中,从安全的角度来看被认为是优选的(所述容器可以是或可以不是根据pct/gb2019/051156的容器)。当然技术人员将了解,在获得样品后,可以在添加到反应容器之前将样品例如在低温下储存某一时间段。如上所述,样品通常将是生物样品,例如可以是从以下中获取的样品:哺乳动物,例如人、牛、猪、奶牛、绵羊、猪、狗、骆驼、马、美洲驼、山羊、兔、猫、大鼠、小鼠、雪貂、豚鼠、水貂或其它模型生物。在其它实施例中,样品是从禽鸟物种获取的样品。在其它实施例中,样品是从鱼类获取的样品。优选地,样品是人类样品或来自牛的样品。最终被检测的微生物或病毒颗粒可以是任何微生物或病毒颗粒,例如可以是病毒、细菌、原生动物或真菌中的任何一种。在优选的实施例中,微生物或病毒是病原微生物或病毒,例如根据“生物药剂分类(classificationofbiologicalagents)”,美国国家公共卫生与环境研究所(nationalinstituteforpublichealthandtheenvironment),《rivm通信报告(rivmletterreport)》205084002分类的3类或4类病原体:病原体可以是哺乳动物病原体,例如人类病原体、牛病原体、猪病原体、奶牛病原体、绵羊病原体、猪病原体、狗病原体、骆驼病原体、马病原体、美洲驼病原体、山羊病原体、兔病原体、猫病原体、大鼠病原体、小鼠病原体、雪貂病原体、豚鼠病原体、水貂病原体或其它模型生物病原体,或者是禽鸟病原体,或者是鱼类病原体。在其它实施例或相同实施例中,病原体是禽鸟病原体。因此,在一个实施例中,一种或多种微生物或病毒颗粒可以选自由以下组成的组:a)选自由以下组成的组的病毒性出血热:埃博拉病毒、拉沙热、马尔堡病毒病(marburgvirusdisease)、里夫特裂谷热(riftvalleyfever)、刚果热(congofever)和黄热病;和/或b)日本脑炎、登革热(dengue)、寨卡病毒(zika)、基孔肯雅病(chikungunya);c)具有病毒学组分的兽医疾病,包含但不限于pprv、fmdv、btv、新城疫(newcastledisease)、猪流感、bvdv;d)疟疾、hiv、病毒性肝炎、土壤传播的蠕虫寄生虫感染。病毒学包含具有血源性组分的含义。本发明被认为在制备并且随后扩增和检测具有rna基因组的微生物或病毒方面特别有用。在一个实施例中,病毒颗粒是rna病毒颗粒。在一些实施例中,rna病毒颗粒选自由以下组成的组或包括:腺相关病毒、爱知病毒(aichivirus)、澳大利亚蝙蝠狂犬病毒(australianbatlyssavirus)、bk多瘤病毒(bkpolyomavirus)、版纳病毒(bannavirus)、巴马森林病毒(barmahforestvirus)、布尼奥罗病毒(bunyamweravirus)、拉克罗斯布尼亚病毒(bunyaviruslacrosse)、雪兔布尼亚病毒(bunyavirussnowshoehare)、弥猴疱疹病毒(cercopithecineherpesvirus)、金迪普拉病毒(chandipuravirus)、基孔肯雅病毒(chikungunyavirus)、柯萨病毒a(cosavirusa)、牛痘病毒(cowpoxvirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、克里米亚-刚果出血热病毒(crimean-congohemorrhagicfevervirus)、登革热病毒、多里病毒(dhorivirus)、道格比病毒(dugbevirus)、杜文哈格病毒(duvenhagevirus)、东部马脑炎病毒(easternequineencephalitisvirus)、埃博拉病毒、艾柯病毒(echovirus)、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus)、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)、欧洲蝙蝠狂犬病毒(europeanbatlyssavirus)、gb病毒c/庚型肝炎病毒(gbvirusc/hepatitisgvirus)、汉坦病毒(hantaanvirus)、亨德拉病毒(hendravirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、马痘病毒(horsepoxvirus)、人腺病毒、人星状病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠道病毒68,70、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒1、人乳头瘤病毒2、人乳头瘤病毒16,18、人副流感病毒、人细小病毒b19、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人sars冠状病毒、人逆转录病毒、人t淋巴细胞性病毒、人环曲病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒(isfahanvirus)、jc多瘤病毒(jcpolyomavirus)、日本脑炎病毒、呼宁砂粒样病毒(juninarenavirus)、ki多瘤病毒(kipolyomavirus)、昆津病毒(kunjinvirus)、拉哥斯蝙蝠病毒(lagosbatvirus)、维多利亚湖马尔堡病毒(lakevictoriamarburgvirus)、兰加特病毒(langatvirus)、拉沙病毒、洛兹达雷病毒(lordsdalevirus)、跳跃病病毒(loupingillvirus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocyticchoriomeningitisvirus)、马丘波病毒(machupovirus)、马雅罗病毒(mayarovirus)、中东呼吸综合征(mers)冠状病毒、麻疹病毒尤库尼米、孟戈脑心肌炎病毒(mengoencephalomyocarditisvirus)、默克尔细胞多瘤病毒(merkelcellpolyomavirus)、莫科拉病毒(mokolavirus)、传染性软疣病毒(molluscumcontagiosumvirus)、猴痘病毒(monkeypoxvirus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、墨累山谷脑炎病毒(murrayvalleyencephalitisvirus)、纽约病毒(newyorkvirus)、尼帕病毒(nipahvirus)、诺沃克病毒(norwalkvirus)、阿尼昂尼昂病毒(onyong-nyongvirus)、口疮病毒(orfvirus)、奥罗普切病毒(oropouchevirus)、皮秦德病毒(pichindevirus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、庞塔托鲁静脉病毒(puntatorophlebovirus)、普马拉病毒(puumalavirus)、狂犬病病毒(rabiesvirus)、裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus)、罗莎病毒a(rosavirusa)、罗斯河病毒(rossrivervirus)、轮状病毒a、轮状病毒b、轮状病毒c、风疹病毒(rubellavirus)、鹭山病毒(sagiyamavirus)、萨利病毒a(salivirusa)、白蛉热西西里病毒(sandflyfeversicilianvirus)、扎幌病毒(sapporovirus)、塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)、汉城病毒(seoulvirus)、猴泡沫病毒(simianfoamyvirus)、猴病毒5、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)、南汉普顿病毒(southamptonvirus)、圣路易斯脑炎病毒(st.louisencephalitisvirus)、蜱传播的玻瓦桑病毒(tick-bornepowassanvirus)、细环病毒(torquetenovirus)、托斯卡纳病毒(toscanavirus)、病毒(uukuniemivirus)、牛痘病毒(vacciniavirus)、水痘带状疱疹病毒(varicella-zostervirus)、天花病毒(variolavirus)、委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelanequineencephalitisvirus)、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)、西部马脑炎病毒(westernequineencephalitisvirus)、wu多瘤病毒(wupolyomavirus)、西尼罗病毒(westnilevirus)、雅巴猴肿瘤病毒(yabamonkeytumorvirus)、雅巴样疾病病毒(yaba-likediseasevirus)、黄热病病毒(yellowfevervirus)、寨卡病毒(zikavirus)。本发明被认为适用于包膜和非包膜病毒的处理和后续扩增。如上所述,在存在包括洗涤剂、溶剂和一种或多种核酸聚合酶的试剂的情况下,将样品在容器中加热到至少70℃的温度。在优选的实施例中,不对样品进行进一步的物理操纵,或者一旦添加样品,就不向容器中添加另外的材料,因此包括洗涤剂和溶剂的试剂应与一种或多种核酸聚合酶相容以允许酶在下游扩增中起作用。相容性是指试剂应基本上维持酶的最大活性。例如,酶应保留至少98%、96%、94%、92%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%的活性。技术人员将理解,当用于不同的试剂中时如何确定聚合酶的最大活性和聚合酶的活性的相对变化。例如,可以使用裸露的rna模板进行实时pcr反应,例如,使用其中供应有酶的缓冲液可以认为提供了100%活性。可以确定添加试剂各种组分的效果,例如通过添加吐温(tween)和/或甘油并测量聚合酶的性能。在一些实施例中,如果在存在试剂的情况下用聚合酶进行扩增,即任何量的扩增,则试剂与聚合酶相容。因此,在一个实施例中,试剂与一种或多种聚合酶相容。实际上,如果在存在特定试剂组分的情况下反应的ct处于在不存在所述试剂组分的情况下反应的ct的0.5以内,则认为是合适的。技术人员将理解,试剂的哪些组分将与特定的聚合酶相容。进一步地,在相同或替代实施例中,试剂与其中供应有一种或多种聚合酶的试剂相容。技术人员将理解,通常可商购获得的聚合酶以液体形式供应并且因此已经与各种组分相关联。认为在某些情况下,其中供应有聚合酶的试剂与可降低或抑制聚合酶活性的本发明的试剂之间可能存在相互作用。如上所述,技术人员将意识到这一点并且可以采取步骤以确保本发明的试剂与酶的试剂相容。在其它实施例中,将聚合酶冻干供应,在所述情况下,聚合酶尚未与任何试剂相关联并且因此这种相容性不是问题。优选地,在添加了样品的容器中供应冻干的聚合酶。本领域技术人员将意识到,聚合酶也可以以纯酶液相供应,即其中酶尚未处于任何试剂中或在没有任何相关的储存缓冲液的情况下供应。由于在一些情况下,靶核酸是rna,所以释放的rna本身的热稳定性是另一个问题。技术人员意识到,rna在存在含二价阳离子的碱性溶液的情况下降解(vallessm、strongca、bussea、oidh.“蚂蚁中的职蚁尼氏蚁属中的rna的非酶水解(non-enzymatichydrolysisofrnainworkersoftheantnylanderiapubens)”.《昆虫科学杂志(jinsectsci.)》2012;12:146.doi:10.1673/031.012.14601)。因此,如果将本文所述的制备方法与通常基于tris和4mmgcl2的标准taq聚合酶缓冲液一起使用,则任何释放的rna将会被快速地降解并且靶rna无法扩增。技术人员将理解,所述试剂因此可以包括一种或多种缓冲剂。所述试剂可以包括任何缓冲剂,并且技术人员知道此类药剂。然而,在一个实施例中,试剂不包括tris。本申请人已开发出了在样品被加热到的温度下,即高于70℃(例如其中靶核酸是病毒核酸的衣壳tm)时,基本上ph为中性的缓冲液,并且所述缓冲液在那些温度以上变为中性。技术人员将理解,缓冲液的pka指示在给定温度下缓冲液的ph将是否处于中性。例如,bicine的pka为0.018ph/c。进一步地,所述系统缓冲二价阳离子,使得自由浓度最小化。在一些实施例中,试剂因此是基于bicine或tricine的,典型的配方可以是50mmbicine/tricine、3.5mmmgcl2、115mm乙酸钾并且调节到在25℃下ph为8.2。此试剂在温度高于70℃时例如在衣壳tm(衣壳变性点)下基本上是中性的,并且由此,不存在过多的氢氧根离子攻击rna,但ph值将符合逆转录/扩增步骤中酶的生理要求,所述逆转录/扩增步骤将在温度为55c到65c且ph为7.4-7.6的范围内进行。因此,一个实施例提供了一种试剂,所述试剂在以下温度下的ph为大约6.5-7.5:介于大约70℃-100℃之间,任选地介于72℃与98℃之间、介于74℃与96℃之间、介于76℃与94℃之间、介于78℃与92℃之间、介于80℃与90℃之间、介于82℃与88℃之间或介于84℃与86℃之间;任选地其中所述试剂在70c下的ph为7.45和/或在95℃下的ph为7.0。因此,在优选的实施例中,试剂将rna降解最小化并且上面已经给出合适组分的实例。由于通常需要二价阳离子作为聚合酶活性的辅因子,因此在一些实施例中,如果试剂缓冲二价阳离子,则其被认为是重要的。合适的缓冲液包含bicine和tricine。在另一个实施例中,优选基于bicine的缓冲液。bicine的浓度可以是任何浓度。因此,在一个实施例中,所述试剂包括bicine。在另一个实施例中,所述试剂包括以下浓度的bicine:介于20mm与70mm之间的bicine、介于25mm与65mm之间的bicine、介于30mm与60mm之间的bicine、介于35mm与55mm之间的bicine、介于40mm与50mm之间的bicine、或大约50mmbicine。在另一个或相同的实施例中,所述试剂包括浓度为至少20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm的bicine。在另一个或相同的实施例中,所述试剂包括浓度小于70mm、65mm、60mm、55mm、50mm、45mm、40mm、35mm、30mm、25mm或20mm的bicine。在另一个实施例中,所述试剂包括tricine,例如包括上述指示的浓度的tricine。如上文所讨论的,所述试剂需要至少一种溶剂和至少一种洗涤剂。在一个实施例中,溶剂是甘油。在相同或另一个实施例中,洗涤剂是吐温,例如吐温20。因此,在一个实施例中,溶剂是甘油和/或洗涤剂是吐温,例如吐温20。在一个实施例中,所述试剂包括吐温(聚山梨醇酯),例如吐温20,其浓度为至多0.4%,例如浓度为a)至少0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%;和/或b)小于0.4%、0.35%、0.3%、0.25%、0.2%、0.15%、0.1%、0.075%、0.05%、0.025%;和/或c)介于0.025%与0.4%之间、介于0.05%与0.35%之间、介于0.075%与0.3%之间、介于0.1%与0.25%之间、介于0.15%与0.2%之间;例如其中吐温的浓度介于0.15%与0.3%之间。在一个实施例中,所述试剂包括浓度为11%或小于11%的甘油,任选地其中所述试剂包括小于11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或更少的甘油。在相同或替代的实施例中,所述试剂包括浓度介于0.5%与11%之间、介于1%与10%之间、介于2%与9%之间介于3%与8%之间、介于4%与7%之间或介于5%与6%之间的甘油。在相同或替代的实施例中,所述试剂包括浓度大于0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或大于11%的甘油。如以上所讨论的,在存在一种或多种聚合酶的情况下将样品加热到至少70℃。已知加热微生物如细菌会破坏细菌并使得核酸接近扩增所需的组分,如聚合酶和引物。还已知加热病毒可以使核酸接近核酸染色剂(tr)并破坏中和病毒tm的病毒衣壳的蛋白质构象(walter等人2012《病毒学方法杂志(jvirolmethods)》–pastry方法)。walter等人2012中所述的tr是比tm低的温度。尽管tr与病毒灭活和核酸对核酸染色剂的可接近性两者相关,但是本发明的发明人已经确定将病毒加热到此较低的tr温度不足以使病毒核酸可扩增。事实上,即使将病毒加热到tm,在其下病毒蛋白质改变构象的温度(衣壳变性温度)也不足以使核酸扩增。本发明人已经证明,在存在洗涤剂和溶剂如吐温和甘油的情况下仅当将病毒加热到病毒的tm时,才可以扩增病毒核酸。应当理解,在存在聚合酶的情况下加热样品不是采用的典型方法,因为在高于70c的温度下,大多数rna依赖性dna聚合酶是变性的。因此,本发明需要耐热的rna依赖性dna聚合酶(其中需要此类活性)。本文提供了此类酶的实例。本发明人已经发现,对于迄今为止测试的所有病毒,每种单独病毒的tm(衣壳变性温度)都在76℃-81℃的范围内。然而,某些病毒或微生物将需要更高的温度。由于本发明的试剂被认为对任何dna或rna都具有保护性,因此认为使用较高的温度是合适的,特别是在处理尚未与所述方法一起使用且尚未进行优化的病毒或微生物时。然而,技术人员将理解,在可能的情况下应使用较低的温度来保持核酸和聚合酶活性。可替代地,加热到较高的温度意味着可以使用较短的加热持续时间。在一些实施例中,优选的是保持加热的持续时间较短,即使这意味着使用更高的温度。将样品加热到70c或更高被认为将会使靶病毒或微生物核酸中的至少一些靶病毒或微生物核酸变得可扩增,例如变得可接近聚合酶和其它扩增组分,尽管70c可能不是最佳的。技术人员将知道如何优化温度,例如通过使用合适范围内若干不同温度多次实行如本文所讨论的本发明的方法。然而,在一个优选实施例中,将样品加热到93-95c,因为这适用于所有样品并且不需要优化。技术人员将理解,尽管对于给定的样品类型和病毒/微生物,将存在在可接近的核酸与核酸降解之间提供最佳平衡的最佳温度和加热持续时间。加热到95c还具有以下优点:尽管较低的温度可以使核酸可接近扩增组分,但是在一些情况下,核酸将具有阻止扩增的二级结构。加热到大约95c确保了去除核酸中的任何二级结构。本申请人已经观察到,通过向扩增试剂混合物中添加溶剂/洗涤剂可以降低tm点-使病毒或微生物核酸可接近扩增组分的点。许多溶剂洗涤剂组合在商业上用于病毒灭活,尽管发现这些溶剂洗涤剂组合与许多扩增方法在很大程度上不相容。发现合适的组合为8-11%的甘油和0.15-1%的吐温20(最佳地,8-9%甘油和0.15-0.3%吐温)。对于吐温,添加的百分比确实进一步降低了tm点,但是本申请人还观察到,较高的吐温浓度(0.4%)降低了如用于pcr过程的任何引物和探针的杂交温度,并且因此可以观察到pcr效率下降。单独加热不能使病毒rna可扩增,即,达到tm点并使rna可接近嵌入染料,但此rna无法扩增。它需要正确的热处理和正确的溶剂/洗涤剂混合物浓度。这被认为是由于甘油和吐温的组合有助于衣壳蛋白质的变性并确保没有脂质或蛋白质与释放的rna保持相关联,因此其可通过聚合酶扩增。优选的一组反应条件如下:50mmbicine、3.4mmmgcl2、115mm乙酸钾、8%甘油、0.2%吐温,在25c下ph为8.2。2.5-4mmmgcl2的一系列mgcl2浓度产生扩增子,但3.4mmmgcl2是最佳的。在一个实施例中,将样品加热到:a)介于大约70℃-100℃之间,任选地介于72℃与98℃之间、介于74℃与96℃之间、介于76℃与94℃之间、介于78℃与92℃之间、介于80℃与90℃之间、介于82℃与88℃之间或介于84℃与86℃之间;和/或b)至少72℃、74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、96℃、88℃、90℃、92℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃或大于100℃。在一些实施例中,将样品加热到介于大约76℃与81℃之间,特别是在样品中的靶核酸是病毒核酸并且怀疑样品包括病毒颗粒的实施例中。例如可以加热到至少76.0℃、76.5℃、77.0℃、77.5℃、78.0℃、78.5℃、79.0℃、79.5℃、80.5℃、81.0℃或81.5℃。在其它实施例中,例如特别是在尚未确定病毒的tm(衣壳变性)温度的情况下,将样品加热到大约93-95℃,持续1-5秒的时间段。在一些实施例中,例如在样品是微生物如细菌或真菌的情况下,将样品加热到90-95c,持续例如30秒到60秒。技术人员将理解,将包括rna(例如病毒rna)的样品加热到95c不是采用的典型方法,因为使用现有技术方法,rna将降解。类似地,在存在rna依赖性dna聚合酶的情况下将rna加热到95c不是采用的常规方法,因为聚合酶将被降解。因此,在一个实施例中,样品包括或预期包括病毒rna或者靶核酸是病毒rna,并且聚合酶具有rna依赖性dna聚合酶活性,并且将样品加热到90c以上,例如加热到95c,持续1、2、3、4或5秒。可以将样品加热到所需温度,持续任何时间长度。然而,并且如上所述,技术人员将理解,当使用核酸进行操作时,优选的是最小化暴露于高温下。因此,在一个实施例中,将样品加热到所需的温度,持续:a)介于0.5秒与5秒之间、介于1秒与4.5秒之间、介于1.5秒与4秒之间、介于2秒与3.5秒之间或介于2.5秒与3秒之间;和/或b)至少0.5秒、1秒、1.5秒、2秒、2.5秒、3秒、3.5秒、4秒、4.5秒或至少5秒;和/或c)小于5秒、4.5秒、4秒、3.5秒、3秒、2.5秒、2秒、1.5秒、1秒、0.5秒、0.25秒。在优选的实施例中,将样品加热到所需温度,持续大约1秒,例如介于0.5秒与1.5秒之间。在特别优选的实施例中,例如在靶核酸是病毒rna的情况下,将样品加热到介于大约74℃与84℃之间例如持续大约1秒,例如介于0.5秒与1.5秒之间;或加热到95℃持续大约1秒,例如介于0.5秒与1.5秒之间。另外的问题是释放的rna本身的热稳定性,rna在存在含二价阳离子的碱性溶液的情况下降解(缓冲液和镁离子的联合催化活性促进的非酶rna水解)。因此,如果本文所描述的过程与基于tris和4mmgcl2的标准taq聚合酶缓冲液一起使用,则释放的rna会迅速降解并且使得靶病原体rna不可扩增。为了克服此问题,本申请人已经开发了在衣壳tm温度下ph基本上为中性且在高于这些温度下ph变为中性的缓冲剂,进一步地,所述系统缓冲二价阳离子(“goods”缓冲液消耗的游离金属离子,rnakon、crkrishnamoorthy,《科学(science)》1983年8月19日:第221卷,第4612期,第749-750页),使得基于bicine和tricine-典型的配方可以是50mmbicine/tricine、3.4mmmgcl2、115mm乙酸钾并且调节到在25c下ph为8.2-使游离浓度最小化,此缓冲液在tm(衣壳变性点)下基本上是中性的,并且由此不存在过量的氢氧根离子攻击rna,但ph值将符合逆转录/扩增步骤中酶的生理要求,ph为7.4-7.6。在一些实施例中,试剂在以下温度下有利地处于中性ph,例如ph6.5-7.5:介于大约70℃-100℃之间,例如介于72℃与98℃之间、介于74℃与96℃之间、介于76℃与94℃之间、介于78℃与92℃之间、介于80℃与90℃之间、介于82℃与88℃之间或介于84℃与86℃之间;例如其中所述试剂在95℃的温度下的ph为7。在一些实施例中,试剂还包括一种或多种二价阳离子。聚合酶通常需要金属离子才能发挥活性,并且每种酶可能需要不同的辅因子。例如,dna依赖性dna聚合酶通常需要mg阳离子,而一些聚合酶的rna依赖性dna聚合酶活性需要mn阳离子。因此,在一些实施例中,试剂包括一种或多种二价阳离子。技术人员精通确定使用哪种聚合酶需要哪些辅因子。应当理解,如果试剂的一些或全部组分被冻干供应,则可能是有利的。例如,由于本发明特别适合在难以获得制冷的炎热地区基于现场使用,因此供应冻干的组分减少了组分的降解。因此,在一些实施例中,容器可以包括冻干的组分,如聚合酶。冻干的组分还可以大量供应。在相同或其它实施例中,可以将冻干的组分重悬浮于“重悬浮”试剂中,所述重悬浮试剂包括不能冻干供应的那些组分。在优选实施例中,在将样品添加到容器之前,将冻干的组分重悬浮于重悬浮缓冲液中并放置在容器中(如果冻干的组分尚未在容器中供应)。然后将盖子密封关闭并且不需要再次打开。一旦已经进行了扩增和检测,就可以安全地破坏样品和容器。最终,在将任何冻干的组分重悬浮于重悬浮试剂中之后,存在对随后发生的扩增反应所必需的所有组分,包含聚合酶。然后在将样品加热到至少70℃之前添加样品。例如,重悬浮缓冲液可以由甘油、tweem20和水以及一些盐如氯化镁组成,可以向此重悬浮缓冲液中添加用于防止微生物生长的药剂如叠氮化钠,尽管其它的抗微生物剂在本领域是已知的。如所讨论的,病毒或微生物可以包括是dna或rna的靶核酸。技术人员将理解,例如为了通过pcr反应来扩增dna,需要单一的聚合酶活性,即dna依赖性dna聚合酶。技术人员理解,存在许多可商购获得的dna依赖性dna聚合酶,例如taq聚合酶、vent聚合酶、kod、tli。技术人员还理解,在模板靶核酸是rna的情况下,为了扩增rna,首先必须使用rna依赖性rna聚合酶将其转化为cdna。已知的rna依赖性聚合酶包含bioneerrocketscript、superscript、amv、mmulv、fiv等。通过rna依赖性dna聚合酶进行逆转录,然后通过dna依赖性dna聚合酶对所得的cdna进行扩增。因此,在一些情况下,试剂可以包括多于一种聚合酶,并且可以例如包括rna依赖性dna聚合酶和dna依赖性dna聚合酶。如上文所述,需要耐热性的聚合酶以耐受与制备样品和下游扩增过程相关的高温。然而,优选地,在模板靶核酸是rna的情况下,试剂中存在单一聚合酶,所述单一聚合酶能够实行rna依赖性dna聚合酶功能和dna依赖性dna聚合酶功能。因此,在一个实施例中,试剂包括如上文所述的至少两种不同的聚合酶。还设想了酶的其它组合,例如试剂可以包括具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性的聚合酶,但是试剂还可以包括具有dna依赖性dna聚合酶活性的另外的聚合酶,所述酶被认为可以增加扩增期间/之后获得的荧光产量。这些可以以例如1:1、2:1、3:1的比率包含在内,以有利于任一种聚合酶。合适的dna聚合酶包含kod、tli、hemotaq、kapa血液、phusion、tth。在相同或另一个实施例中,聚合酶具有rna依赖性dna聚合酶活性并且不具有dna依赖性dna聚合酶活性,例如聚合酶是bioneerrocketscript。聚合酶应是其中rna依赖性dna聚合酶活性和/或dna依赖性dna聚合酶活性可以在样品被加热到的温度下(例如在使核酸例如病毒核酸可接近扩增组分的温度下)短暂保持。在相同或另一个实施例中,聚合酶具有dna依赖性dna聚合酶活性并且不具有rna依赖性dna聚合酶活性。在又另外的实施例中,试剂包括具有rna依赖性dna聚合酶活性但无dna依赖性dna聚合酶活性的聚合酶,并且还包括具有dna依赖性dna聚合酶活性但无rna依赖性dna聚合酶活性的单独的聚合酶。在优选实施例中,聚合酶具有dna依赖性dna聚合酶活性、rna依赖性聚合酶活性或具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性两者,任选地其中聚合酶选自由以下组成的组:a)tth聚合酶(普洛麦格企业(promega))[seqidno:3]b)hawkz05(罗氏企业(roche)),[seqidno:4]c)wo2014/023318中描述的聚合酶d)与seqidno:1、2、3、4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的聚合酶,任选地其中所述聚合酶包括相对于seqidno:1、2、3或4的以下突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个突变:s515r、i638f、m747k、l322m、l459m、s739g、e773g和l789f;e)与m1/m747k酶[seqidno:2]具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的聚合酶。优选的酶与seqidno:1、2、3、4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性,任选地其中所述聚合酶包括相对于seqidno:1、2、3或4的以下突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个突变:s515r、i638f、m747k、l322m、l459m、s739g、e773g和l789f;或者是与m1/m747k酶[seqidno:2]具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的聚合酶;因为这些酶中的某些酶被认为在扩增期间比hawkz05更耐受血液的存在并且在逆转录方面比tth更好。在实例中提供了由此类酶产生的扩增数据。如果一种或多种聚合酶对一些样品如血液中发现的抑制剂具有天然抗性或已经被工程化为对所述抑制剂具有抗性,则其也是优选的。例如,酶tth被认为对存在于血液中的抑制剂具有天然抗性(《科学报告(scientificreports)》第8卷,文章编号:3410(2018))。与seqidno:1、2、3、4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的某些酶,任选地其中所述聚合酶包括相对于seqidno:1、2、3或4的以下突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个突变:s515r、i638f、m747k、l322m、l459m、s739g、e773g和l789f;或者与m1/m747k酶[seqidno:2]具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的酶被认为对血液中发现的抑制剂具有抗性。seqidno:1是指水生栖热菌(thermusaquaticus)聚合酶的氨基酸序列:seqino:2是指如wo2014/023318中所描述的具有m747k取代的m1聚合酶:seqidno:3是指tth聚合酶序列:seqidno:4是指hawkz05聚合酶序列:应当理解,在制备样品的方法和随后产物的扩增和检测将为“封闭管”的情况下,即,一旦将扩增和检测所需的样品和材料放置在容器内,容器就关闭并且不再打开,并且其中存在聚合酶,使得存在rna依赖性dna聚合酶和dna依赖性dna聚合酶活性两者(由于容器中存在至少两种不同的聚合酶,一种具有rna依赖性dna聚合酶活性并且另一种具有dna依赖性dna聚合酶活性;或者其中存在具有两种活性的单一聚合酶;或者其中存在具有两种活性的单一酶,并且存在具有dna依赖性dna聚合酶活性或rna依赖性dna聚合酶活性的至少一种另外的酶),优选的是rna依赖性dna聚合酶活性不需要作为dna依赖性dna聚合酶活性抑制剂的辅因子,和/或dna依赖性dna聚合酶活性不需要作为rna依赖性dna聚合酶活性抑制剂的辅因子。在优选实施例中,rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性两者需要镁阳离子作为辅因子。技术人员将清楚的是,在靶核酸是rna的情况下,例如在病毒是rna病毒的情况下,如果聚合酶具有rna依赖性dna聚合酶活性,或者例如具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性两者,则其是优选的。如上文所讨论的,样品可以是任何样品类型,但优选地是粗样品。样品可以为任何体积并且可以具有相对于样品和试剂的组合体积的任何相对体积。然而,本方法被认为适合用于高相对体积样品,例如在一个实施例中,样品占样品和试剂的总体积的至少5%,例如至少6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%或35%或更高;任选地占样品和试剂的总体积的13%。如实例中所述,在样品是血液或血清的情况下,优选的浓度是大约12-16%的血液或血清。不希翼受到任何理论的束缚,在此类浓度下的分子拥挤被认为增加了扩增反应的效率。以此方式,可以使用足够大的样品,例如粗样品,例如全血,但仍以小体积进行扩增和检测。例如,在一些实施例中,样品(例如粗样品,例如全血)的体积小于100ul,例如小于90ul、80ul、70ul、60ul、50ul、40ul、30ul、20ul、15ul、12ul、10ul、5ul、4ul、3ul、2ul、1ul、0.5ul。使用小体积的样品可以降低暴露于病毒或微生物的风险。例如,样品体积可以介于0.5ul与100ul之间,例如介于1ul与90ul之间,例如介于2ul与80ul之间、介于3ul与70ul之间、介于4ul与60ul之间、介于5ul与50ul之间、介于10ul与40ul之间、介于15ul与30ul之间或为20ul。在一些优选实施例中,粗样品是5ul、10ul、12ul、15ul或20ul。容器中的样品和试剂的总体积可以介于10ul与500ul之间、介于20ul与450ul之间、介于30ul与400ul之间、介于40ul与350ul之间、介于50ul与300ul之间、介于60ul与250ul之间、介于70ul与200ul之间、介于80ul与150ul之间、介于90ul与140ul之间、介于100ul与130ul之间、介于110ul与120ul之间。例如,总体积可以小于500ul、400ul、300ul、200ul、100ul、90ul、80ul、70ul、60ul、50ul、40ul、30ul、20ul或10ul。在一些优选实施例中,总反应体积为50ul、60ul、70ul、80ul、90ul、62ul、72ul、82ul、92ul、102ul、75ul、85ul、95ul、105ul、110ul。因此,在一些实施例中:a)容器中的样品的体积i)小于100ul,例如小于90ul、80ul、70ul、60ul、50ul、40ul、30ul、20ul、15ul、10ul、5ul、4ul、3ul、2ul、1ul、0.5ul;和/或ii)介于0.5ul与100ul之间,例如介于1ul与90ul之间,例如介于2ul与80ul之间、介于3ul与70ul之间、介于4ul与60ul之间、介于5ul与50ul之间、介于10ul与40ul之间、介于15ul与30ul之间或为20ul;和/或b)容器中的样品和试剂的总体积可以介于i)10ul与500ul之间、20ul与450ul之间、30ul与400ul之间、40ul与350ul之间、50ul与300ul之间、60ul与250ul之间、70ul与200ul之间、80ul与150ul之间、90ul与140ul之间、100ul与130ul之间、110ul与120ul之间;和/或ii)可以小于500ul、400ul、300ul、200ul、100ul、90ul、80ul、70ul、60ul、50ul、40ul、30ul、20ul或10ul。在一些优选实施例中,样品的体积是10ul并且容器中样品和试剂的总体积是60ul、70ul、80ul或90ul,或样品的体积是12ul并且容器中样品和试剂的总体积是62ul、72ul、82ul、92ul、102ul,或样品的体积是15ul并且总体积是75ul、85ul、95ul或105ul。如上文所述,在一些实施例中,所述方法是基于现场的并且适合在现场中使用。现场使用包含在非标准实验室环境中使用的含义。在一个实施例中,现场使用意指在电力受限或只能由电池供电的环境中使用。在相同或不同的实施例中,现场使用包含以下含义:其中针对容器将要使用的物质的性质,没有为临床医师、实验室科学家或其它处理容器的人员配备合适的安全设备。例如,在一些实施例中,容器将用于检测高致病性病毒和细菌并且通常将用于容纳来自受试者的样品或在某些情况下的环境样品如在现场使用,处理容器的人员可以只配备有非常基础的安全设备。还包含以下含义:所述方法低成本、简单且生物安全,其要求最小化暴露于样品并且一旦样品被添加到容器中,容器就不会再次打开。还包含以下含义:所述方法可以使用最少的能量如电能来进行,并且不需要冷冻、离心样品,并且无需扩增或必需冷藏或冷冻的试剂组分。在优选的实施例中,样品直接从受试者中获取并与试剂一起直接放置在容器中。在一些实施例中,特别是在样品包括血液或包括全血的情况下,试剂包括辅助血液凝结的药剂。如上文所讨论的,血液的存在既干扰经过扩增的产物的荧光检测,又由于pcr抑制剂的存在而抑制扩增本身。本发明人已经发现,如果血液凝结,则例如在扩增反应的时间过程期间它将相对快速地下沉到容器的底部。凝结的血液尽管可用于向容器提供病毒或微生物核酸,但其浸出扩增抑制剂的能力较弱。从上面显而易见的是,本发明提供了一种用于制备样品以用于直接扩增存在的微生物或病毒核酸的方法。因此,得出结论,本发明还提供了一种扩增存在于从受试者获得的样品中的微生物或病毒核酸的方法,其中所述样品是根据本发明的方法制备的。制备样品的方法的特征给出的偏好适用于整个说明书,例如适用于扩增方法。例如,以上给出的样品类型、体积、试剂组分、温度、聚合酶等的偏好适用于扩增方法。在一个实施例中,使用pcr或q-pcr进行扩增。在一些实施例中,扩增涉及在pcr之前的逆转录步骤,例如逆转录pcr(rt-pcr),例如实时逆转录pcr(rt-qpcr)。本发明人出乎意料地发现,在靶核酸是rna例如病毒rna的情况下,进行多于一个的逆转录酶周期是可能且有益的,并且在rna丰度低的情况下尤其有益。例如,逆转录通常只有10-20%的效率(mirandaja;stewardgf,“影响逆转录定量pcr(rt-qpcr)效率和说明的变量:使用噬菌体ms2的经验研究(variablesinfluencingtheefficiencyandinterpretationofreversetranscriptionquantitativepcr(rt-qpcr):anempiricalstudyusingbacteriophagems2)”.《病毒学方法杂志》.2017;241:1-10),所以在rna的拷贝数量预期为每次反应少于100个拷贝的情况下,多轮逆转录被认为是特别有益的。以此方式,重复rna到cdna的逆转录,并且需要将样品加热到足够高的温度以分离所得cdna杂交体链,例如加热到95c。技术人员将理解,此实施例需要可以承受加热到95c的聚合酶。虽然已经报道了其它明显的周期性rt方法(例如,bioneerwo2008115002),但是那些方法从来没有实现cdna的变性温度。众所周知,dna/rna杂交体的熔点高于对应dna的熔点,因此如果扩增子长度超过80bp,则必需将任何反应加热到超过94c才能可靠地使所得杂交体变性。这意味着所述公开中描述的最高温度无法使杂交体变性,因此产生的cdna分子绝不会超过存在的rna分子的数量。biorad在wo2014138688中描述了一种进行至少两轮逆转录的方法,然而这描述了一种区隔反应策略,其中每个样品被分解成多个纳升反应,其中每个在理论上是每次反应单个靶标。这是一个主要的区别,因为它需要提取的核酸,在粗样品中每纳升的病原体不足以使此方法起作用,并且它特别地要求进行区隔反应。本质上,这是一种确保成功转录每个分区中的单个靶标的方法,其与设计用于产生比本文所述的原始存在的rna的数量多的cdna分子的方法相反。当预期反应中存在极少量的靶标时,这种预扩增是使灵敏度最大化的关键。所述方法可以涉及任何数量的逆转录周期。逆转录周期包含以下含义:允许合适酶的rna依赖性dna聚合酶活性将rna逆转录为dna链。第二周期将需要将样品加热到阈值温度,在所述阈值温度下,rna:dna杂交体解缔,从而使聚合酶接近rna。将温度降低至延伸温度,并从相同的模板rna分子产生第二条dna链。在一些实施例中,扩增涉及多于一个逆转录步骤,即,涉及重复性逆转录,例如,在pcr之前的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个逆转录周期。在一些实施例中,驱动逆转录的反向引物与驱动pcr的反向引物相同。在这种情况下,本申请人已经发现了进一步的改进,即操纵驱动逆转录的引物的熔点,使得可以将rt与pcr分离或者确实使两者的性能最大化。如果将驱动逆转录的引物的tm(即,将50%的引物结合到预期靶标上的点)与其dna的tm分离,则本申请人已经证明,可以将反应仅偏向于逆转录,即,反应可以在仅形成cdna的温度下进行并且pcr反应不能启动,因为逆转录是在太高的温度下进行的,以至于引物与反应中的任何dna结合。一种此类修饰是将锁核酸并入反向引物序列(“pcr引物中锁核酸增加了灵敏度和性能(lockednucleicacidsinpcrprimersincreasesensitivityandperformance)”.《基因组学(genomics)》,issn:1089-8646,第91卷,第3期,第301页-5,2008),修饰的rna分子不成比例地增加rna模板的tm并且因此使反应偏向于cdna的产生。例如序列gagtaggag{t}{t}{t}gtgaaagtgtc(其中括号表示lna修饰)的dna的tm为64c,而rna的tm为78c。因此,可以在例如75c下进行逆转录而又不产生pcr产物,因此重复性逆转录的特征是反向引物的tm至少比其对应的dna靶标的tm高9c,并且可以在6c下或大于tm(对于dna)时进行逆转录。此时,少于1%的引物可以与dna靶标结合,由此进行了很大的逆转录,因此它表示预扩增步骤,这对于此方法是至关重要的,其中当患者以3,000个病毒体/ml感染时,受感染的血液每微升血液仅含3个靶标。标准rt-qpcr在反应将开始之前需要存在数十个拷贝,因此此预步骤表示提高诊断灵敏度的必要步骤。可以设计驱动重复性逆转录和pcr的引物,以便a)基于温度将逆转录与pcr分开;或者b)允许同时进行逆转录和pcr。在一些实施例中,驱动逆转录的反向引物的熔点不同于驱动pcr的正向引物的熔点,使得根据反应的温度,a)进行逆转录,b)进行pcr,或者c)同时进行逆转录和pcr两者。如果正向引物的dna的tm与反向引物的rna靶的tm相差超过6c,则可以在防止pcr发生的同时进行有效的逆转录。在优选实施例中,引物的熔点差为大约5-6c。技术人员将理解,引物的rna或dna的tm主要由序列的gc含量驱动。在一些实施例中,逆转录反应的温度超过dna/rna杂交体的熔融温度。在一些实施例中,一种或多种引物包括一种或多种lna、zna和/或bna修饰,例如在一些实施例中,反向引物包括一种或多种lna、zna和/或bna修饰。一种或多种引物还可以或替代地包括一种或多种lna、zna和/或bna修饰。本领域技术人员将理解,扩增如pcr或rt-pcr或rt-qpcr可以用于产生多种长度(例如20bp到5,000bp)的扩增子。然而,出于当前目的,即疾病诊断,优选较短的扩增子,因为需要的扩增反应较短,这意味着可以更快地获得诊断结果。因此,在一些实施例中,扩增产生扩增子,所述扩增子的长度介于40bp与500bp之间,例如介于50bp与450bp之间,例如介于60bp与400bp之间,例如介于70bp与350bp之间,例如介于80bp与300bp之间,例如介于90bp与250bp之间,例如介于100bp与200bp之间,例如大约150bp。优选地,所得扩增子的大小为60bp到100bp。如上文所讨论的,例如由于生物安全的原因,在已经添加了样品并且在其中已经制备了样品的同一容器中进行扩增反应具有益处。因此,在一个实施例中,在与根据制备根据本发明的样品的方法在其中制备样品的容器相同的容器中进行扩增反应。在另一个实施例中,一旦样品和试剂处于容器中,就将容器密封并且在整个扩增反应中不再打开。在相同或不同的实施例中,一旦样品和试剂处于容器中,就不将样品或试剂的任何部分从容器中去除:a)在所述加热之前;和/或b)在所述加热之后;c)在rt之前;和/或d)在pcr之前;和/或e)在rt期间;和/或f)在pcr期间;和/或g)在rt之后;和/或h)在pcr之后。在一些实施例中,所述方法是扩增核酸的封闭管方法。技术人员将理解封闭管方法的含义,并且通常要求一旦将样品与制备方法或下游扩增和检测步骤的任何必要组分一起添加到容器中,就将容器封闭,例如通过将盖封闭或将盖子密封到容器上,并且盖或盖子不会再次打开。例如,在封闭管方法的一些实施例中,不添加另外的材料或从容器中去除另外的材料,例如,不提取核酸或不以任何方式纯化核酸。技术人员将理解,扩增(例如pcr)使用至少正向引物和反向引物进行。在某些情况下,如qpcr或rt-qpcr,可以用合适的荧光团或允许检测扩增子的其它染料标记引物。反应还可以使用探针,如荧光标记的探针。在样品是血液且血液渗出光路之外的情况下,或者对于血液以外的样品,合适的荧光团的收集波长范围跨度从500nm的fam到750nm的alexafluor680,并且涵盖本领域已知的任何荧光团,例如tet、hex、cy5。在不下沉(或离心)的情况下,血液样品需要远红外染料,包含cy5;alexafluor657、680、594;pulsar650;quasar670;cy5.5;quasar705以及在630nm与750nm之间发射的其它染料。由于在优选的实施例中,一旦将样品添加到容器中就不会干扰样品,因此在一些实施例中,样品和试剂不在逆转录步骤与pcr步骤之间进行操纵。[一步rt-pcr]技术人员将理解,除了提供一种制备用于扩增的样品的方法和提供扩增的方法之外,本发明还提供了一种检测从受试者获得的样品中微生物或病毒颗粒的存在的方法,其中已经根据本发明制备了样品和/或其中根据本发明扩增了来自微生物或病毒颗粒的核酸,随后检测了经过扩增的核酸。如上文所述,在一些实施例中,扩增产生与扩增子数量相对应的荧光信号。例如,荧光标记的引物可以并入扩增子中,或荧光标记的探针可以用于定量制备的扩增子的量或扩增子的存在。技术人员知道用于进行反应和检测扩增子的定量pcr(qpcr/rt-qpcr)和可用选项。在一些实施例中,例如当荧光标记的染料/引物已经用于反应中,用分光光度计检测扩增子。技术人员将理解,分光光度计可以捕获所有发射的光,例如介于300-900nm之间,然后可以使用允许其在特定范围(例如在510-580nm和655-750nm的两个窗口中)内观看的滤光器。这意指可以使用属于这些波长范围的任何染料且无需校准样品或计算光谱重叠或正常光学系统的任何其它问题。因此,在一个实施例中,在扩增期间用一种或多种荧光标记的引物或一个或多个探针标记扩增子并使用分光光度计检测所得的荧光,所述分光光度计用两个510-580nm和655-750nm的窗口捕获介于300-900nm之间的所有光。对于非病原性病毒或微生物,或不被认为是危险的病原性病毒或微生物,本发明的封闭管实施例被认为是不太重要的并且因此可以使用检测扩增子的其它手段如电泳法,和/或扩增子可以被测序以进行流行病学研究。本发明还提供了一种试剂,其用于本发明的任何方法,例如用于样品制备和/或用于本发明的扩增方法,和/或用于根据本发明的检测方法,其中试剂包括洗涤剂、溶剂和一种或多种核酸聚合酶。对本发明的此方面的特征的偏好如本文其它地方所定义,例如对溶剂、洗涤剂、聚合酶、每种组分的浓度、ph等的偏好如本文所定义。如上文所讨论的,在一些实施例中,试剂使rna降解最小化。同样如上文所讨论的,在一些实施例中,试剂不包括tris。试剂可以包括bicine,例如可以包括以下浓度的bicine:介于20mm与70mm之间的bicine、例如介于25mm与65mm之间的bicine、例如介于30mm与60mm之间的bicine、例如介于35mm与55mm之间的bicine、例如介于40mm与50mm之间的bicine、例如大约50mmbicine。在优选实施例中,试剂缓冲二价阳离子。在一些实施例中,溶剂是甘油和/或洗涤剂是吐温,例如吐温20。在特定实施例中,试剂包括吐温,例如浓度为至多0.4%的吐温20,和/或包括浓度为至多11%的甘油,例如其中所述试剂包括11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或更少的甘油。如上文所述,试剂包括一种或多种聚合酶。在一些实施例中,试剂包括至少两种不同的聚合酶。例如,在一个实施例中,聚合酶具有dna依赖性dna聚合酶活性、rna依赖性聚合酶活性或具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性两者,任选地其中聚合酶选自由以下组成的组:a)tth聚合酶(普洛麦格企业(promega))[seqidno:3]b)hawkz05(罗氏企业),[seqidno:4]c)wo2014/023318中描述的聚合酶d)与seqidno:1、2、3、4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的聚合酶,任选地其中所述聚合酶包括相对于seqidno:1、2、3或4的以下突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个突变:s515r、i638f、m747k、l322m、l459m、s739g、e773g和l789f;e)与m1/m747k酶[seqidno:2]具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的聚合酶。优选的酶与seqidno:1、2、3、4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性,任选地其中所述聚合酶包括相对于seqidno:1、2、3或4的以下突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个突变:s515r、i638f、m747k、l322m、l459m、s739g、e773g和l789f;或者是与m1/m747k酶[seqidno:2]具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的聚合酶;因为这些酶中的某些酶被认为在扩增期间比hawkz05更耐受血液的存在并且在逆转录方面比tth更好。在实例中提供了由此类酶产生的扩增数据。如果一种或多种聚合酶对一些样品如血液中发现的抑制剂具有天然抗性或已经被工程化为对所述抑制剂具有抗性,则其也是优选的。例如,酶tth被认为对存在于血液中的抑制剂具有天然抗性。与seqidno:1、2、3、4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的某些酶,任选地其中所述聚合酶包括相对于seqidno:1、2、3或4的以下突变中的1、2、3、4、5、6、7或8个突变:s515r、i638f、m747k、l322m、l459m、s739g、e773g和l789f;或者与m1/m747k酶[seqidno:2]具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的酶被认为对血液中发现的抑制剂具有抗性。试剂还可以包括具有rna依赖性dna聚合酶活性的第一聚合酶和具有dna依赖性dna聚合酶活性的第二聚合酶。试剂还可以包括具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性的第一聚合酶和具有dna依赖性dna聚合酶活性的第二聚合酶。在任一种情况下,试剂可以包括的第一聚合酶与第二聚合酶的比率为1:1到5:1,例如可以包括的第一聚合酶与第二聚合酶的比率为至少1:1、1:2、1:3、1:4或至少1:5。试剂还可以包括的第二聚合酶与第一聚合酶的比率介于1:1与5:1之间,例如可以包括的第一聚合酶与第二聚合酶的比率为至少1:1、1:2、1:3、1:4或至少1:5。例如,试剂可以包括具有rna依赖性dna聚合酶活性的第一聚合酶和具有dna依赖性dna聚合酶活性的第二聚合酶,其中第一聚合酶与第二聚合酶的比率介于1:1与5:1之间,例如可以包括的第一聚合酶与第二聚合酶的比率为至少1:1、1:2、1:3、1:4或至少1:5;或其中第二聚合酶与第一聚合酶的比率介于1:1与5:1之间,例如可以包括的第一聚合酶与第二聚合酶的比率为至少1:1、1:2、1:3、1:4,或至少1:5。在另一个实例中,试剂可以包括具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性的第一聚合酶和具有dna依赖性dna聚合酶活性的第二聚合酶,其中第一聚合酶与第二聚合酶的比率在1:1到5:1之间,例如可以包括第一聚合酶与第二聚合酶的比率至少为1:1、1:2、1:3、1:4或至少1:5;或其中第二聚合酶与第一聚合酶的比率在1:1至5:1之间,例如可以包括第一聚合酶与第二聚合酶的比率至少为1:1、1:2、1:3、1:4或至少1:5。试剂可以包括1、2、3、4、5种或更多种具有相同或不同活性的聚合酶。进一步地,在一些实施例中,试剂包括辅助血液凝结的药剂。对辅助血液凝结的药剂的偏好如本文其它地方所述。将理解的是,由于在一些实施例中,扩增反应是封闭管生物安全反应,因此试剂应包括扩增和后续检测所必需的所有组分,从而阻止样品本身。因此,在一个实施例中,试剂包括pcr和/或rt-pcr和或rt-qpcr所必需的组分,例如可以包括:一种或多种引物,例如一种或多种荧光团标记的引物;和/或一种或多种荧光染料;氯化镁;bsa;dntp;精氨酸;随机rna,例如酵母rna;冻干时维持酶活性所需的赋形剂。同样如上文所述,可以将试剂的组分中的一些组分冻干,这具有优点,因为通常不需要冷藏冻干的组分。因此,在一个实施例中,试剂的组分中的一种或多种组分呈冻干形式,任选地以冻干形式在容器中。在一个实施例中,试剂的组分中的一种或多种组分呈冻干形式,任选地以冻干形式在容器中,任选地其中将聚合酶、bsa、一种或多种引物、一个或多个探针或dntp中的一个或多个冻干,任选地一起冻干。如上文所述,本发明人已经发现进行多轮逆转录是可能且有益的。多轮逆转录增加了靶核酸扩增和检测的灵敏度,并且通过使用本发明的试剂在很大程度上保护了样品,特别是样品中的任何rna免于降解,这使得它成为可能。因此,本发明还提供了一种进行rt-pcr的方法,其中所述方法包括在pcr之前或其期间的多于一个逆转录步骤,例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个逆转录步骤。所述方法被认为独立于本发明的其它方法,但是可以与其它方法结合使用。对逆转录酶和重复性逆转录的偏好如本文其它地方所述。如上文所述,在重复性rt方法中,在一些实施例中,驱动逆转录的反向引物与驱动pcr的反向引物相同。进一步地,并且也如上文所述,在一些实施例中,驱动逆转录的反向引物的熔点不同于驱动pcr的正向引物或反向引物的熔点,使得根据反应的温度,a)进行逆转录,b)进行pcr,或者c)同时进行逆转录和pcr两者。例如,引物的熔点差可以为大约5c或更高,并且逆转录进行的温度比dna的tm高6c或更多,使得仅rt可以发生。引物可以包括一种或多种lna、zna和/或bnz修饰,任选地其中反向引物包括一种或多种lna、zna和/或bnz修饰。在一些实施例中,逆转录反应的温度超过dna/rna杂交体的熔融温度。重复性rt可以用于扩增任何大小的扩增子。然而,在优选实施例中,扩增产生扩增子,所述扩增子的长度介于40bp与500bp之间,任选地介于50bp与450bp之间,任选地介于60bp与400bp之间,任选地介于70bp与350bp之间,任选地介于80bp与300bp之间,任选地介于90bp与250bp之间,任选地介于100bp与200bp之间,任选地大约150bp。扩增子将优选地在60-100bp的范围内。本发明还提供了一种用于确定温度的方法,在所述温度下,病毒核酸变得可用于扩增,其中a)所述方法包括根据本发明的方法制备多个样品,其中在pcr或rt-pcr之前将所述多个样品各自单独地加热到一系列不同温度中的一个温度,例如其中制备单个样品并将其加热到71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃之一,任选地加热到76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃;然后b)扩增病毒核酸,例如根据本发明的方法进行扩增;然后c)检测扩增子,任选地根据本发明检测扩增子。很明显,本文描述的方法可以用于确定样品中病毒或微生物的存在或不存在,并且因此可以用于诊断方法。因此,本发明提供了一种用于诊断微生物或病毒感染的存在或不存在的方法,其中根据本发明制备从受试者获得的样品,然后:a)扩增病毒核酸,例如根据本发明的方法进行扩增;然后b)检测扩增子,例如根据本发明检测扩增子,其中检测到所述扩增子的存在表明所述受试者患有所述微生物或病毒感染。技术人员也将清楚,本发明的各个方面和实施例使其本身适合于作为试剂盒提供。例如,本发明提供了一种试剂盒,其包括洗涤剂、溶剂和一种或多种核酸聚合酶。对洗涤剂、溶剂和一种或多种聚合酶的偏好如本文所定义。在一些实施例中,试剂盒还包括反应容器,例如包括35个不可逆锁的容器,使得一旦添加了样品并且将容器密封,就不能再次打开容器。在pct/gb2019/051156中对此类容器进行了描述。试剂盒的各种组分可以呈液体形式或冻干形式。本文描述了对冻干的组分的偏好。本说明书中对显然先前公开的文献的列举或论述不必应视为承认所述文献是目前先进技术的一部分或是公共常识。除非上下文另外指示,否则本发明的给定方面、特征或参数的偏好和选项应该被视为已经与本发明的所有其它方面、特征和参数的任何和所有偏好和选项结合而公开。例如,本发明提供了一种试剂,其包括具有rna依赖性dna聚合酶活性的聚合酶和具有dna依赖性dna聚合酶活性的聚合酶、0.3%吐温和8%甘油。本发明还提供了一种制备样品以用于扩增病毒核酸的方法,所述样品可以包括病毒,其中所述方法包括在存在具有rna依赖性dna聚合酶活性和dna依赖性dna聚合酶活性两者的聚合酶的情况下,将样品在密封容器中加热到95c持续1秒。本发明还提供了一种诊断受埃博拉病毒感染的受试者的方法,其中所述方法包括制备取自所述受试者的2ul血液样品以用于扩增,其中所述制备步骤包括将所述样品加热到95c持续1秒并直接对样品进行rt-pcr或rt-qpcr,然后检测扩增子(如果存在)。附图说明图1a)示出了在85、87、89、91、93、95c下加热持续1秒。b)示出了在71/73/74/76/78/80c下加热持续45秒。c)在78/79/80/81/82c下加热持续20秒。对于此病毒,81/82是最佳的-但所有温度确实可以使病毒核酸可扩增并达到相似程度。使用的测定是gp14测定(trombleyar、wachterl、garrisonj等人“用于线状病毒、沙粒病毒和新世界汉坦病毒的检测和绝对定量的实时taqman聚合酶链反应测定的综合面板(comprehensivepanelofreal-timetaqmanpolymerasechainreactionassaysfordetectionandabsolutequantificationoffiloviruses,arenaviruses,andnewworldhantaviruses)”.《美国热带医学与卫生杂志(amjtropmedhyg.)》2010;82(5):954–960.doi:10.4269/ajtmh.2010.09-0636)。目标是accuplexzebov对照的100个病毒体(seracarellc,目录号0505-001)。50ulrxn、800nmf和r引物、200nmcy5标记的探针和如所描述的试剂-ph为8.2的50mmbicine、3.4mmmgcl2、0.4mmdntp,115mm乙酸钾、0.1ug/ulbsa、0.2%吐温。8.5%甘油、5个单位/rxn的酶与seqid2相同性>95%。热循环方案为85/87/89/91/93/9595c持续1秒变性(病毒裂解)、63c下持续90秒变性(rt步骤)、96c下持续3秒变性(杂交体变性)、57c下持续45秒变性(pcr)、95c下持续3秒变性-重复40次。图2-本发明的方法适用于与多种样品类型一起使用。a)示出了来自血清(0%血液)中以及在9%血液和15%血液下的100个病毒体的核酸的扩增。令人惊讶地,血液的优选量为12-16%,并且血清的优选量为12-16%。b)来自从受感染动物的病变中分离的细胞的pprv病毒的直接检测。c)从感染pprv的动物的猪鼻拭子的系列稀释d)来自脑脊髓液的埃博拉假病毒的直接检测e)以1000细菌/rxn掺有a)表皮葡萄球菌或b)大肠杆菌的全血。这证明了由于所述方法使得细菌核酸可扩增,因此无需核酸提取就可以检测血液中的细菌感染。f)来自病毒培养物的cchf的直接检测g)来自冷冻的受感染患者样品的拉沙病毒的直接检测对于以上所有反应,条件如下:50ulrxn、400-800nmf和r引物、120-200nmcy5标记的探针和如所描述的试剂-ph为8.2的50mmbicine、3.4mmmgcl2、0.4mmdntp,115mm乙酸钾、0.1ug/ulbsa、0.2%吐温。8.5%甘油、5个单位/rxn的酶与seqid2相同性>95%。热循环方案为95c持续1秒变性(病毒裂解)、63c下持续90秒变性(rt步骤)、96c下持续3秒变性(杂交体变性)、57c下持续45秒变性(pcr)、95c下持续3秒变性-重复40次。所有测定均以封闭管形式完成,由此将样品直接添加到混合物中。在容器中按照pct/gb2019/051156的方法进行了实验e和a,从而在将反应容器密封后,在离心机中使其经受500g的离心持续30秒,以将其中含有的红细胞拉到容器底部并制备在其中可以直接检测到病毒体的血浆。使用合适的引物和探针,对于埃博拉病毒,这些是gp14测定(trombleyar、wachterl、garrisonj等人“用于线状病毒、沙粒病毒和新世界汉坦病毒的检测和绝对定量的实时taqman聚合酶链反应测定的综合面板(comprehensivepanelofreal-timetaqmanpolymerasechainreactionassaysfordetectionandabsolutequantificationoffiloviruses,arenaviruses,andnewworldhantaviruses)”.《美国热带医学与卫生杂志(amjtropmedhyg.)》2010;82(5):954–960.doi:10.4269/ajtmh.2010.09-0636)。对于cchf,这些来自(barryatkinson、johnchamberlain、christopherh.logue、nicolacook、christinebruce、stuartd.dowall和rogerhewson.《载体传播和人畜共通传染疾病(vector-borneandzoonoticdiseases)》.2012年9月),对于来自以下出版物中的pprv测定(“用于小反刍兽疫病毒特异性检测的实时rt-pcr测定(arealtimert-pcrassayforthespecificdetectionofpestedespetitsruminantsvirus)”.《病毒学方法杂志》,issn:1879-0984,第171卷,第2期,第401页-4:2011),对于拉沙病毒测定(trombleyar、wachterl、garrisonj等人“用于线状病毒、沙粒病毒和新世界汉坦病毒的检测和绝对定量的实时taqman聚合酶链反应测定的综合面板(comprehensivepanelofreal-timetaqmanpolymerasechainreactionassaysfordetectionandabsolutequantificationoffiloviruses,arenaviruses,andnewworldhantaviruses)”.《美国热带医学与卫生杂志(amjtropmedhyg.)》2010;82(5):954–960),并且最后对于大肠杆菌和表皮葡萄球菌,使用以下的引物和探针:大肠杆菌a2_f2gtaacgcgctttcccacc大肠杆菌a2_r2tgtgggcattcagtctggatc大肠杆菌a2_p2ctgatcaattccacagttttcgcg表皮葡萄球菌_aap_p04-fctgttaatgggttcttagttgttgg表皮葡萄球菌_aap_p04b-rcaaaatatggtccagttgatggaga表皮葡萄球菌_aap_p04-pgttgtaattgtttttgttcctggttcacct图3-吐温(聚山梨酯)允许扩增组分接近核酸,从而产生扩增,而tritonx不允许。a)示出了包括无洗涤剂和最小溶剂的反应,所述溶剂包括6%甘油、0.1%吐温和6%甘油以及0.2%吐温和6%甘油。b)示出了与0.6%、0.9%和1.0%吐温的反应。c)示出了包括0.2%的吐温20和6%的甘油的反应以及0.2%的吐温20和0%的甘油的反应d)示出了包括tritonx的反应。图4a)示出了tth酶的数据-9%血液,其中每次反应1000个病毒体。b)示出了hawkz305酶的数据-6%血液,每次反应100个拷贝。c)示出了具有seqidno:2的酶的数据。50ul反应、800nmf和r引物、200nmcy5标记的探针和如所描述的试剂-ph为8.2的50mmbicine、3.4mmmgcl2、0.4mmdntp,115mm乙酸钾、0.1ug/ulbsa、0.2%吐温。8.5%甘油、5个单位/rxn的酶与seqid2相同性>95%。热循环方案为95c持续1秒变性(细菌裂解)、63c下持续90秒变性(rt步骤)、96c下持续3秒变性(杂交体变性)、57c下持续45秒变性(pcr)、95c下持续3秒变性-重复40次。在反应中掺有15%最终反应体积的人体血液。图5示出了本发明的试剂防止rna降解的数据。在95c下用浓度为3、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0mm的镁进行反应,其中所述温度保持1分钟。这是在bicine缓冲液中进行的。图6-甘油对反应的影响。a)示出了用6%、7%、8%、9%和10%的甘油v/v进行的反应。发现了8-9%是最佳折中。b)示出了与0%和6%的甘油在0.2%的吐温20下的反应图7-吐温对血液下沉的影响。a)0.1%、0.4%和1.0%的吐温在埃彭道夫管(eppendorftube)中对血液下沉的影响。b)在不同浓度下在pcr反应管中,吐温对血液下沉的影响。示出了pcr前后的图像,其中pcr之后在较高浓度的吐温下形成了明显的透明层,所述透明层在较低浓度的吐温下则不存在或几乎没有。c)根据b中的反应设置的扩增数据。图8-多个短暂保持对逆转录酶的影响a)单一的4分钟逆转录步骤以以下形式运行:i)单一保持(0次变性),或者ii)包含许多变性步骤的cdna的许多较短保持,但是其中总保持时间等于(i)的保持时间。b)一组15个相同的反应,每个反应含有16%全人血并且每个反应掺有10种病毒-具有高灵敏度,使得从开始就有许多机会启动pcr,然而拷贝数非常低-这是在商业上满足世界卫生组织针对低成本诊断所要求的至关重要的3,000个病毒体/ml的关键。c)所述方法的典型热曲线-正确的温度需要针对每个步骤进行确定图9a)使用tet标记的血液的pcr;和b)使用cy5标记的血液的pcr。除了探针分别用tet染料或cy5和淬灭剂bhq1或bhq2标记之外,反应是相同的。目标是accuplex埃博拉病毒参考材料。50ulrxn、800nmf和r引物、200nmcy5标记的探针和如所描述的试剂-ph为8.2的50mmbicine、3.4mmmgcl2、0.4mmdntp,115mm乙酸钾、0.1ug/ulbsa、0.2%吐温。8.5%甘油、5个单位/rxn的酶与seqid2相同性>95%。热循环方案为95c持续1秒变性(病毒裂解)、63c下持续90秒变性(rt步骤)、96c下持续3秒变性(杂交体变性)、57c下持续45秒变性(pcr)、95c下持续3秒变性--重复40次。图10-序列比对图11-从粗样品中直接检测的另外的实例:a)使用以6%的最终反应体积添加的冷冻血液的来自受感染小鼠模型的检测裂谷热病毒的直接检测b)来自病毒培养基的克里米亚刚果出血热病毒的直接检测。c)来自受感染的猪血或鼻拭子的小反刍兽疫病毒的直接检测。d)来自pbmc中的病毒培养物的口蹄疫病毒的检测。50ulrxn、800nmf和r引物、200nmcy5标记的探针和如所描述的试剂--ph为8.2的50mmbicine、3.4mmmgcl2、0.4mmdntp,115mm乙酸钾、0.1ug/ulbsa、0.2%吐温。8.5%甘油、5个单位/rxn的酶与seqid2相同性>95%。热循环方案为95c持续1秒变性(病毒裂解)、63c下持续90秒变性(rt步骤)、96c下持续3秒变性(杂交体变性)、57c下持续45秒变性(pcr)、95c下持续3秒变性--重复40次。引物序列如下:cchfs122fcctttttgaactcttcaaacccchfs1rtctcaaagaaacacgtgcccchf探针actcaaggkaacactgtgggcgtaagrvfweidftgccacgagtyagagccarvfweidrgtgggtccgagagtytgcrvfweidptccttctcccagtcagccccacpprvfagagttcaatatgttrttagcctccatpprvrttccccartcactctyctttgtpprvpcaccggayackgcagctgactcagaa实例实例1-使靶核酸可接近扩增组分的所需温度图1a、b和c示出了将样品加热到较高的温度持续较短的时间段比将样品加热到较低的温度持续较长的时间段更优选。超过76c的温度使病毒核酸可接近扩增组分。然而,rna会随时间降解,因此较短保持更优选,其中短暂较冷保持是最优选的。优选的实施例是将样品加热到93-95c持续1秒。实例2-多个样品类型和病毒/微生物本发明适用于多个样品类型,包含血液和血浆(图2a)、来自受感染动物的病变的细胞(图2b)、猪鼻拭子、脑脊髓液、病毒培养物、冷冻的受感染患者血清样品,并且可以用于检测至少拉沙病毒、cchf、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、埃博拉假病毒和pprv。没有理由怀疑本发明不能用于检测任何包括可扩增核酸的病毒或微生物。实例3-吐温和甘油的效果需要洗涤剂以使病毒或微生物核酸可扩增。因此,仅加热到70c以上不足以引起核酸可扩增。吐温能够使病毒或微生物核酸可扩增,但tritonx不能。聚山梨酯80更具亲脂性并且聚山梨酯20更具亲水性,因此所有的测试都使用吐温20(聚山梨酯20)进行,但是没有理由认为其它形式的吐温将也不会起作用。预期的是,由于酶缓冲液包括洗涤剂brij并且brij可能与triton不相容,因此triton不起作用。因此,尽管在一些情况下可能需要评估与酶混合物组分的相容性,但洗涤剂而非吐温被认为适用于本发明的方法和本发明的试剂。假定其它非离子型洗涤剂将与所述过程相容并且是在本领域是已知的。无洗涤剂意指靶核酸不接近扩增组分,例如因为可能需要洗涤剂改变衣壳构象或从核酸中去除蛋白质,并产生裂解和不可重现的数据。添加任何超过0.1%的吐温可使反应重现。当吐温的浓度太高时,它会降低引物/探针的tm。然后,这会通过降低pcr效率和探测来破坏pcr本身。实际上,在这种特定反应中,当其开始降低时,不能使用超过0.7%的量。在样品是血液的情况下,吐温还有助于样品下沉。图7示出了不同浓度的吐温对血液下沉和扩增的影响。从0.1%吐温开始在管的顶部向前形成透明层,其中透明层的大小取决于吐温浓度(0%吐温管在顶部完全没有表现出透明层)。然而,在较高浓度下,吐温会降低引物的tm并降低pcr效率。0.2-0.3%吐温被认为是最佳的,因为它提供了透明层而不降低pcr效率。需要存在溶剂和洗涤剂两者,才能进行有效且可重现的裂解和扩增。实例4本发明的方法适用于一系列聚合酶。图4a示出了获得的tth酶数据,所述酶具有rna依赖性和dna依赖性聚合酶活性。图4b示出了具有两种活性的hawkz05酶的数据。尽管可以使用tth和hawkz05酶,但它们的灵敏度不如与seqidno:2具有90%或95%同一性的酶,因为tth的逆转录酶性能较差并且hawkz05受到血液存在的抑制更大。实例5通过试剂保护rna众所周知,tris和mg的组合会产生带切口的rna(abouhaidar和ivanov,1999znaturforsch54:542-548)。本发明的方法和试剂使rna降解最小化。低rna降解的最好证据是在一系列镁浓度和保持时间范围内的一致性能。图5示出了在94c下的1分钟加热步骤的数据,其中镁为3、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0mm。这在高温下时间相对较长,其中mg2+较高但是ct是相同的。这表明mgcl2增加25%,rna降解无差异。可能的机制以及因此选择bicine/tricine的原因是,已知它们能够缓冲溶液中游离金属离子的量,并且这种作用加上较低的ph将使rna的羟基攻击最小化(“goods”缓冲液消耗的游离金属离子rnakon、crkrishnamoorthy,《科学》1983年8月19日:第221卷,第4612期,第749-750页doi:10.1126/science.6879173)。-这意指rna停留在反应中并且因此如有必要可用于多个逆转录周期。在一些实施例中,本发明的缓冲液在样品经受的高于70c的温度下也是ph中性的。常用缓冲液的ph的温度依赖性。缓冲系统pka/20℃δpka/10℃mes6.15-0.110ada6.60-0.110pipes6.80-0.085aces6.90-0.200bes7.15-0160mops7.20-0.013tes7.50-0.200hepes7.55-0.140trldne8.15-0.210trls8.300.310bicine8.35-0.180双甘氨肽8.40-0.280参考文献good,n.e.(1986)《生物化学(biochemistry)》5,467。根据已发布的数据,bicine下降0.18ph单位/c。因此,在95c下,bicine缓冲液的ph值为7.0并且因此在变性步骤期间不会发生rna攻击,因为这需要过量的氢氧根离子。bicine缓冲液被认为是特别优选的,因为它是唯一在其中显示所有3种酶(tth、hawk305和具有seqidno:2的酶)均起作用的缓冲液,tth将在tris缓冲液中进行pcr,但在bicine中仅进行rt。hawk305将在bicine或tricine中起作用,因此很有可能tricine可以取代bicine。bicine缓冲液还被证明通过对高温和mgcl2浓度免疫而有助于rna存活。实例6-重复性逆转录酶本发明的发明人已经发现,以一系列较短保持(包含cdna变性步骤)而不是单一较长同等时间的保持进行逆转录酶是可能且有益的。图8示出了单一4分钟逆转录步骤的数据,所述步骤既可以作为单一长久保持运行,也可以作为通过cdna变性步骤分解为一系列较短保持运行。每个反应运行相同的总时间长度。应当注意,在相同的固定时间段内实行了更多的rt周期后,最终的荧光较高,这表明更多的rna被转化为cdna。反应含有250个病毒体和9%全人血。5次变性产生了最早的ct,因此6×41秒的rt步骤与14分钟rt步骤所用时间相同,从而改善了数据,因为rna得以存活并且每个周期都产生了新的cdna。rna与dna的键在能量上比dna/dna键更强,作为实际实例,引物序列gatacactgggatgactctttgccgaac的dna的tm为71c,而靶rna的tm为76c。这意指在76c进行逆转录将成功发生rt反应,但如果进行多个周期,则产生很少的pcr产物,这是由于仅1.74%的引物能够在退火温度下结合,所述退火温度比其dna的tm高5c。因此,通过实行多个高温rt步骤可以从同一rna链中产生多个cdna分子,并且因此通过进行此预扩增步骤来提高灵敏度。所述试剂确保rna分子在升高的温度下存活足够长的时间,使得可以实现多个周期。另一种策略是设计引物,其中通过使用锁核酸(lna),rna的tm和dna的tm距离更接近。lna是rna物种,其确认锁定在具有稳定链内结合的3-内切确认中。因此,当lna部分将tm提升到rna靶标时,正向和反向的dna的tm更靠近在一起。然后可以设计测定,由此rt和pcr可以在同一温度下有效地进行--pcr是一种基于初始目标拷贝数加倍的扩增化学方法,其与简单的单一拷贝转录或逆转录相反。因此,如果两者均可以在相同温度下有效地进行,则灵敏度将达到最大化,因为有效的pcr将在同一时间启动,rt功能仍为初始低拷贝数的rna靶标转化成随后可以扩增和检测到的cdna提供初始机会。由于试剂使rna降解最小化,这意指靶核酸如病毒rna保留在溶液中,并且每个周期为rna转化为cdna提供了更多机会。图8b示出了一组15个相同的反应,每个反应含有16%全人血并且每个反应掺有10种病毒。高灵敏度来自从开始就具有许多启动pcr的机会,然而拷贝数非常低--这是在商业上满足世界卫生组织针对低成本诊断所要求的至关重要的3,000个病毒体/ml的关键。在这种情况下,引物被设计为允许rt和pcr同时进行。发现此种方法是最灵敏的。使用可以进行rt和pcr的酶的缺点是很难分离所述两种功能。为了确定重复性rt的最佳温度,必需在一系列温度范围内对检测灵敏度进行比较(参见图8c)。温度越高且保持时间越长,则可能从样品中释放的抑制剂如血液就更多,因此希翼将温度最小化并保持尽可能多的时间,这也加快了检测时间。实例7所述方法适用于在任何波长下发射并激发的任何荧光团将来自表达埃博拉病毒基因组(accuplexseracare)的sinbis病毒的病毒核酸从血样中扩增并用tet标签(图9a)或cy5标签(图9b)进行标记。tet标签在大约521nm下激发并在大约536nm下发射,然而cy5标签约在大约625nm或650nm下激发并在大约670nm下发射。因此,由于所述方法和试剂适用于检测在光谱的相对端用红色和绿色荧光团标记的扩增子,因此本发明被认为适用于任何荧光团。实例8-优选实施例发现可以应用于各种样品类型/病毒/微生物的最佳反应条件是50mmbicine、3.4mmmgcl2、115mm乙酸钾、8%甘油、在25c下ph为8.2的0.4%吐温。来自3-4mmmgcl2的一系列mgcl2浓度产生扩增子,但3.4mmmgcl2被证明是最佳的。优选地,使用酶m1/m747k(seqidno:2)。用于在封闭管测定中直接从粗样品中检测病毒病原体的方法可以如下。将粗样品添加到含有50mmbicine、3.5mmmgcl2、115mm乙酸钾、8%甘油、25c下ph为8.2的0.4%吐温和酶,优选地m1/m747k或与seqidno:2具有至少90%或至少95%同一性的酶、对所关注的一个或多个靶标具有特异性的引物和序列特异性荧光探针的反应容器中。将反应容器的温度升到95c持续1秒。(使病毒/微生物核酸可接近扩增组分)将温度降至逆转录步骤的最佳温度,如由对所关注的靶标具有特异性的引物序列确定。在96c下使靶标变性持续3秒。任选地实行多轮重复性逆转录。从所得的cdna进行qpcr扩增并检测所得的扩增子。此优选的热循环方案如图8c所示。缓冲液1×mgcl20.4mmbsa0.1ug/ukdntps0.4mm吐温0.2%酶5u/50ul正向引物1um反向引物1um探针0.25um无核酸酶的水bicine-ph8.2*50mm甘油9%v/vmgci23.4mm乙酸钾115mm牛血清白蛋白0.1mg/ml吐温0.2%vol/voltris-hci-ph9.2*1mm硫酸铵0.32mm缓冲液浓度bicine(mm)乙酸钾(mm)乙酸镁(mm)氯化镁(mm)25℃下的pha10×500850258.0b10×500850257.8c10×500850258.0d10×500850257.8e10×500850288.2f10×5001150398.2g10×500850308.2h10×500950308.2实例9本说明书描述了使病原体核酸直接扩增成为可能的试剂和方法,并且特别涉及直接来自怀疑被感染的全血样品的rna病毒。所述方法还可以应用于细菌和真菌病原体,并可以从许多不同的输入样品中获取,包含血清、血浆、尿液、脑脊髓液、粪便和取自眼睛、鼻子和嘴巴中的拭子。另外,描述了通过使反应经受多轮逆转录其中靶病原体是病毒,而建立最大灵敏度的方法,并且确定单个病毒病原体将被裂解并因此被检测的点的方法。本说明书包含实行在单个封闭管过程中从粗全血样品中直接扩增病毒病原体而无需依靠进行核酸提取的必要的方法,从而使快速低成本的现场诊断成为可能。许多方法已经显示了适合于病毒病原体的灭活,包含uv、溶剂/洗涤剂和加热。热处理通常用于生物活性底物如血液或血液产物中的病毒病原体灭活,其中已经证明在区域中缓慢加热到60c下不会使病原体如hiv和hepc具有传染性。最近的研究(fry等人“用于病毒稳定性和疫苗调配物的基板高通量测定法(aplate-basedhigh-throughputassayforvirusstabilityandvaccineformulation)”,《病毒学方法杂志》,第185卷,第1期,2012,第166-170页)称之为pastry技术已经表明热灭活是处于2阶段过程,凭借在较低的温度(tr)下病毒基因组从衣壳中释放出来并且较高温度(tm)衣壳本身会被降解。通过这些过程中的任何一个,所述病毒都将变为非感染性的。编辑发明了这种生产疫苗的方法,对于任何给定的病毒,都有可能确定何时发生基因组释放,而衣壳本身仍然完好无损,从而使减毒疫苗更可靠。本说明书的编辑已经发现,tm点与可扩增病毒核酸被释放的点重合,在tr点上一些蛋白质组分,大概是核蛋白质与病毒基因组保持搭配使用,以使得其无法通过分子生物学方法如等温扩增或pcr进行扩增。具有一种使病毒病原体可直接从粗样品中扩增的方法是有利的,因为通常需要耗时的提取过程,在此过程中需要熟练的操作人员,并且操作人员可能会暴露于致命的病原体。本说明书的编辑提出如果有可能将粗样品添加到怀疑含有病毒病原体并将温度提升到病毒tm点的反应容器中,则有可能直接扩增其中释放的病毒基因组。申请人(bg研究)先前已经描述了一种用于病原体封闭管裂解以释放可扩增核酸的方法(ep2585581),此处的方法的益处是减少了能源需求,因为其无需冷冻并且另外的益处就是比多次循环的冷冻更快速。申请人已经对许多病原体包含登革热进行了pastry方法,并发现迄今为止测试的所有重要病原体的tm在74-84c范围内。因此,如果在74-84c的范围内核酸扩增过程中添加一个单一短暂保持,则理论上可以直接扩增所含病毒病原体。应当注意,大多数重要的致命病原体,包含埃博拉病毒、拉沙病毒、sars病毒以及其它病毒,都具有正义链rna基因组,因此,逆转录步骤对于成功扩增病原体很重要。文献中的大多数天然逆转录酶如mmulv和更现代的修饰酶将通过tm点病毒衣壳变性所必需的这些较高温度来进行变性。因此,在本说明书中描述的过程需要使用热稳定的酶,如bioneerrocketscript其可以在短时间内移动到这些温度下。另外的问题是释放的rna本身的热稳定性,rna在存在含二价阳离子的碱性溶液的情况下降解(缓冲液和镁离子的联合催化活性促进的非酶rna水解)。因此,如果本文所描述的过程与基于tris和4mmgcl2的标准taq聚合酶缓冲液一起使用,则释放的rna会迅速降解并且使得靶病原体rna不可扩增。为了克服此问题,本申请人已经开发了在衣壳tm温度下ph基本上为中性且在高于这些温度下ph变为中性的缓冲剂,所述缓冲液缓冲二价阳离子,使得基于bicine和tricine--典型的配方可以是50mmbicine/tricine、3.5mmmgcl2、115mm乙酸钾并且调节到在25c下ph为8.2--使游离浓度最小化,此缓冲液在tm(衣壳变性点)下基本上是中性的,并且由此不存在过量的氢氧根离子攻击rna,但ph值将符合逆转录/扩增步骤中酶的生理要求,ph为7.4-7.6。申请人已经观察到,可以通过向扩增试剂混合物中添加溶剂/洗涤剂降低tm点,许多溶剂洗涤剂组合物在商业上用于病毒灭活,尽管发现这些与许多扩增方法在很大程度上不相容。发现合适的组合物是8%甘油和0.1-0.4%吐温20。对于,添加的百分比确实进一步降低了tm点,但是申请人还观察到,较高的吐温浓度(0.4%)降低了任何引物和探针的杂交温度,如pcr过程的杂交温度发现最佳反应条件是50mmbicine、3.5mmmgcl2、115mm乙酸钾、8%甘油、25c下ph为8.2的0.4%吐温。直接从粗样品中检测病毒病原体的方法如下。将粗样品添加到反应容器中,所述容器中含有50mmbicine、3.5mmmgcl2、115mm乙酸钾、8%甘油、25c下ph为8.2的0.4%吐温以及适合于进行逆转录和cdna扩增/检测的酶。在15-60秒内将反应容器的温度升至76-81c。(病毒裂解步骤)将温度降到逆转录步骤的最佳温度从所得的cdna进行扩增迄今为止,已证明76-81c是所有测试的病毒的tm(衣壳变性)的正确范围,超过此温度会导致rna快速降解,从而降低灵敏度。兽医检测方法在兽医领域,最普遍使用的样品类型是拭子--这些拭子根据所怀疑的疾病从眼睛、鼻子或嘴巴中获取。许多毒性动物病原体如牛瘟和pprv具有病毒学组分,但是对于一些具有重要经济意义的疾病,可以在血液中发现病毒病原体的时间窗口非常有限。本申请人已经描述了用于直接检测全血的方法并且这已经显示了适用于急性病毒疾病如口蹄疫和pprv的检测(kavitshah、emmabentley、adamtyler、kevinsrichards、edwright、lindaeasterbrook、dianelee、clairecleaver、louiseusher、janeeburton、jamespitman、christinebbruce、davidedge、martinlee、nelsonnazareth、davidanorwood、sterghiosathanasiosmoschos.“可现场部署、定量、快速鉴定未处理血液中的活性埃博拉病毒感染(field-deployable,quantitative,rapididentificationofactiveebolavirusinfectioninunprocessedblood)”.《化学科学(chem.sci.)》,2017;doi:10.1039/c7sc03281a)--然而,在这些疾病很普遍的偏远、资源匮乏的环境中使用直接血液法有许多缺点。首先,从动物身上获取血液样品需要训练有素的兽医的输入,其次,病毒可以在非专业人员可以获取的易于获得的样品中找到。本申请涵盖了一种用于实行病毒性动物病原体的直接检测且无需借助核酸提取的方法,所述病毒性动物病原体直接来自从嘴巴、眼睛或鼻子中获取的拭子样品。实例10用于检测现实世界中的粗样品的病毒病原体的方法的实用性进一步证明是能够检测一系列重要的病毒病原体。图11(a)示出了来自受感染小鼠的裂谷热病毒的直接检测,(b)直接来自病毒培养物的克里米亚刚果出血热病毒的检测,以及(c)直接来自血液或鼻拭子样品的小反刍兽疫病毒的检测。这证明了所述方法在为影响动物和人类的新兴疾病创建快速、低成本诊断方法方面的实用性。从拭子中提取信息的能力意指可以轻松地识别出呼吸系统疾病,并且所述技术具有检测世界卫生组织列出的10大病毒病原体的能力,并且已经被用于生成埃博拉病毒、拉沙病毒、登革热病毒、裂谷热病毒、马尔堡病毒、克里米亚刚果热以及重要的兽医疾病如口蹄疫(d)和pprv的概念数据证明,其在发展中国家引起了巨大的经济影响,同时在全球范围内也具有商业用途,可以在临盆地和关键的港口进行动物筛选。实例11证明了与容器和来自pct/gb2019/051156的教导相结合,可以以每次反应至多3%的最终体积检测到全血中的病毒病原体,其具有很高的灵敏度并满足直接来自血液检测的技术目标,所述技术目标满足世界卫生组织研发蓝图目标3,000个病毒体/ml。图8b示出了以1042个病毒体/ml进行的15个相同反应,其易于满足灵敏度要求并证明所述方法的实用性。图12a和b证明了所述试剂和方法在反应体积中至多35%的全血下可靠地工作,有趣的是,灵敏度似乎在12-16%的范围内有所提高。这被认为是分子拥挤引起的(sasaki,y.、miyoshi,d.和sugimoto,n.(2006).“分子拥挤对dna聚合酶活性的影响(effectofmolecularcrowdingondnapolymeraseactivity)”.《生物技术杂志(biotechnologyjournal)》,1(4),440-446.),其中实现分子拥挤效益最大化同时最小化血液组分的抑制的点必须与此12-16%范围相对应。实际上,这意指含有15ul全血的95ul反应约为16%,并且图8b具有10个拷贝/rxn,并且因此灵敏度为1042个病毒体/ml。当前第1页1 2 3 
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